去甲腎上腺素對VSMC增殖和細胞骨架蛋白、SM22α表達的影響.pdf

1、研究目的：探討NE對血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化、細胞增殖和骨架蛋白表達的影響以及它們之間的關(guān)系。 實驗方法： 取健康SD大鼠腹主動脈作原代培養(yǎng)，用第2和6代的細胞做實驗。 實驗分別將第2和6代的細胞分為血清培養(yǎng)和血清饑餓兩個大組。每組又分成NE作用組和對照組，各組按檢測方法不同可分為：①用于免疫細胞化學(xué)染色觀察的接種在放有小玻片的24孔板內(nèi)，細胞按5×104個/ml細胞密度每孔1ml，每組6孔；②用于RT-PC

2、R檢測的接種于50ml培養(yǎng)瓶中，每組2瓶，細胞按5×105個/ml細胞密度每瓶4ml。用含12％FCS的DMEM培養(yǎng)液，置37℃，5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時后，細胞貼壁，換用0.5％FCS DMEM培養(yǎng)24h進行同步化處理(使所有細胞處于細胞周期的靜止期)，再用12％FCS的DMEM培養(yǎng)72小時后，實驗組加入NE(NE 5×10-5mol/L)作用24小時后收細胞，標(biāo)記細胞增殖的收細胞前24小時加入5-BrDU(終濃度為8×10-4m

3、ol/1)。用于免疫細胞化學(xué)檢測的細胞用4％多聚甲醛固定，用于PCR檢測的細胞保存在-20℃和4℃。其中血清饑餓組在用12％FCS的DMEM培養(yǎng)72小時后，換成無血清饑餓培養(yǎng)48小時，實驗組加入NE(NE 5×10-5mol/L)作用，其它步驟與血清培養(yǎng)組相同。 結(jié)果： 一、NE對血管平滑肌細胞表型的影響 SM22a是收縮型VSMC表型標(biāo)志基因。正常VSMC表達SM22a，但在體外血清培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)代

4、數(shù)的增加，SM22a表達逐漸減少，NE有下調(diào)SM22a的表達，血清饑餓培養(yǎng)在第二代或第六代都可使SM22a的表達上調(diào)。 二、NE對血管平滑肌細胞增殖的影響 體外血清培養(yǎng)的VSMC隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，標(biāo)記的增殖細胞逐漸增多。在同一代細胞中，NE作用組與對照組相比較，增殖的細胞明顯增多。而血清饑餓培養(yǎng)，其增殖的細胞減少。 三、NE對血管平滑肌細胞骨架蛋白的影響 正常VSMC表達SM a-actin、β

5、-Tubulin和Desmin，在體外培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加SM ct-actin、β-Tubulin和Desmin三種蛋白的表達均減少，其中β-Tubulin和Desmin減少十分顯著，至第六代細胞未能檢測出其表達。NE作用后這三種骨架蛋白的表達下調(diào)。 結(jié)論： 1.NE可以促VSMC增殖和表型從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。 2.NE可下調(diào)SM a-actin、β-Tubulin和Desmin骨架蛋白的表達