細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1小干擾RNA治療實驗性肝纖維化.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝臟對慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，以肌成纖維細胞(MFs)大量生成，細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過多沉積為特征，導(dǎo)致組織疤痕形成及肝實質(zhì)正常結(jié)構(gòu)破壞。既往認為，肝星狀細胞(HSCs)是肌成纖維細胞的最主要來源。晚近研究表明MFs有多種來源，尤其是膽管細胞和肝細胞已被證明可通過上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(EMT)向MFs轉(zhuǎn)化。
　　 細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1(ERK1)是促分裂原活

2、化蛋白激酶(MAPK)信號傳導(dǎo)通路的重要激酶之一。未激活的ERK1/2多數(shù)位于胞漿，活化后入核，調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為。ERK參與轉(zhuǎn)化生長因子β-1(TGF-β1)或醛固酮誘導(dǎo)的近端小管細胞EMT及腎纖維化。在肝臟，ERK1/2通路介導(dǎo)血小板衍化生長因子-D(PDGF-D)及瘦素等激活MFs?；罨腅RK1/2可調(diào)控JunD，使金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)表達增加，膠原降解減少。我們前期基因芯片研究結(jié)果表明

3、，隨著肝纖維化進展，ERK1表達顯著上調(diào)。用針對ERK1的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染活化的HSC，可明顯抑制其增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并減少膠原合成?？傊?，以上研究表明，ERK1參與肝纖維化進程，選擇性抑制ERK1可能成為肝纖維化治療的新靶點。
　　 本課題旨在探討ERK1 siRNA對肝纖維化的作用及其機制。研究結(jié)果表明腺病毒介導(dǎo)的siRNA可顯著抑制ERK1表達，體內(nèi)導(dǎo)入AdshERK1可緩解膽總管結(jié)扎(BDL)或二甲基亞硝胺

4、(DMN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，其機制可能是通過抑制HSC增殖、活化，同時逆轉(zhuǎn)膽管上皮細胞或肝細胞EMT。
　　 [實驗方法]
　　 一、重組復(fù)制缺陷型腺病毒AdshERK1構(gòu)建及鑒定
　　 化學(xué)合成ERK1 shRNA正向鏈和反向鏈，退火磷酸化，裝入pSuper，再將目的基因連同H1啟動子酶切，與無啟動子的pShuttle連接獲得穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1-shERK1，與pAdEasy-1質(zhì)粒同源重組后篩選

5、獲得pAdshERK1，測序鑒定目的基因序列的正確性。將線性化的pAdshERK1轉(zhuǎn)染293細胞包裝，獲得AdshERK1。以同樣方法構(gòu)建對照病毒AdshNC。將AdshERK1體外感染活化的肝星狀細胞株HSC-T6，以RT-PCR、Westernblot和免疫細胞熒光法檢測ERK1在HSC-T6中的表達。
　　 二、ERK1 siRNA抑制HSC-T6生物學(xué)特性的體外研究
　　 將病毒感染HSC-T6，MTT法測定其增

6、殖曲線，Real-time RT-PCR、Western-blot及免疫細胞熒光法檢測ERK1表達，同時測定Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1及TGF-β1等肝纖維化相關(guān)基因的mRNA量。
　　 三、ERK1 siRNA抑制肝纖維化的體內(nèi)研究
　　 (一)AdshERK1對BDL大鼠肝纖維化的抑制作用
　　 將雄性Sαrague-Dawley(SD)大鼠隨機分為4組，每組8只，分設(shè)假手術(shù)組、Model組、AdshN

7、C組和AdshERK1預(yù)防組。制備BDL肝纖維化模型。術(shù)前2d AdshNC組和AdshERK1組分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入2×109空斑形成單位/只(pfu/只)AdshNC或2×109 pfu/只AdshERK1。另設(shè)治療模型，病毒導(dǎo)入時間改為術(shù)后3d，其余同預(yù)防模型。術(shù)后3w處死大鼠，Real time RT-PCR及免疫組織化學(xué)法測定肝組織ERK1及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-平滑肌激動蛋白(α-SMA)表達；堿水解法測定各組肝組織羥脯氨酸含

8、量；HE、Masson和Sirius red染色測定ECM含量并對肝纖維化程度分級，圖象分析儀半定量分析。
　　 (二)AdshERK1對DMN損傷大鼠肝纖維化的抑制作用
　　 將雄性SD大鼠隨機分為4組，每組8只，第1組為正常對照組，2～4組予1％DMN按100μl/100g體重腹腔注射，每周連續(xù)注射3次，共4w。其中第2組設(shè)為Model組，第3組為AdshNC導(dǎo)入組，第4組為AdshERK1導(dǎo)入組。于第6次注射DMN

9、后，AdshERK1組和AdshNC組分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入2×109 pfu/只AdshERK1或2×109pfu/只AdshNC，注射病毒2w后處死大鼠，觀察指標同BDL模型。
　　 四、下調(diào)ERK1表達對肌成纖維細胞、肝星狀細胞及EMT的作用
　　 免疫組化雙標法檢測ERK1與MFs標志α-SMA表達位置的關(guān)系。連續(xù)切片免疫組化法測定α-SMA與HSC標志物結(jié)蛋白(desmin)、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)。顯微鏡下隨

10、機選取多個相同區(qū)域?qū)Ρ葍煞N細胞的位置及數(shù)量，以明確ERK1表達與HSC的關(guān)系及HSC在MFs形成過程中的作用。免疫組化雙標法檢測BDL模型各組肝組織中膽管上皮細胞標志物細胞角蛋白19(CK19)與α-SMA的表達位置關(guān)系。免疫熒光雙標法檢測DMN模型各組肝組織中肝細胞標志物白蛋白與α-SMA的位置關(guān)系。免疫組化法檢測上皮細胞標志物上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)及間質(zhì)細胞標志物波形蛋白(Vimentin)和Snail表達。免疫組

11、化法檢測肝組織中增殖細胞核抗原(PCNA)表達。
　　 五、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行分析，結(jié)果以(-X)±SD表示。多組間采用One-Way ANOVA分析，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗；P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為具有非常顯著性差異。
　　 [結(jié)論]
　　 一、ERK1 siRNA可抑制活化肝星狀細胞HSC-T6 ERK1表達，減慢其增殖并下調(diào)肝纖維化相關(guān)基

12、因表達。
　　 二、ERK1 siRNA可明顯抑制BDL和DMN肝纖維化大鼠肝臟ECM沉積，是治療實驗性肝纖維化新的有效方法。
　　 三、纖維化過程中活化的肌成纖維細胞不僅來自于肝星狀細胞，也來自于膽管上皮細胞或肝細胞EMT。
　　 四、ERK1表達與肌成纖維細胞活化有關(guān)，ERK1 siRNA可抑制肌成纖維細胞活化。
　　 五、ERK1 siRNA治療肝纖維化的主要機制是抑制肝星狀細胞活化和逆轉(zhuǎn)膽管上皮細