實(shí)驗(yàn)性肝纖維化動物模型的建立及中藥花芝肝泰抗肝纖維化的作用研究.pdf

1、肝纖維化是機(jī)體對所有慢性肝臟疾病的一種主動的損傷修復(fù)反應(yīng),特點(diǎn)為細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積,發(fā)展到晚期表現(xiàn)為肝臟內(nèi)纖維膠原彌漫性分布,原有的規(guī)則有序的小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞,代之以再生結(jié)節(jié),即為肝硬化。肝硬化將導(dǎo)致肝衰竭、門脈高壓、腹水等多種嚴(yán)重的并發(fā)癥。全世界每年有140萬人死于肝硬化,肝硬化居全美死亡原因的第七位。由于缺乏安全有效的預(yù)防和治療藥物,一旦發(fā)展到肝硬化階段,唯一有效的治療手段就是肝移植。因此,在早期階段,即肝纖維化階段進(jìn)行干預(yù)就顯得

2、尤為重要。
　　抗肝纖維化的環(huán)節(jié)主要包括去除病因,抗炎抗氧化,抑制細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。目前的抗肝纖維化藥物主要包括γ-干擾素(IFN-γ)、秋水仙堿、青霉胺等抑制膠原合成的藥物,但其治療效果并不理想。中醫(yī)理論認(rèn)為肝纖維化的發(fā)病機(jī)制為多方面原因致肝絡(luò)阻塞、血瘀氣滯,以致肝脾失養(yǎng),升降失司,水濕停留,腹內(nèi)積塊和腹水相繼而成。其辨證以脾虛或腎虛為本,瘀血或兼有氣滯為標(biāo)。其治療針對病因以扶正化瘀、攻補(bǔ)兼施為主。治法上多

3、采用健脾養(yǎng)肝補(bǔ)腎,隨癥加用活血行氣、軟堅化瘀、利水之品。國內(nèi)文獻(xiàn)報道的中醫(yī)藥復(fù)方,如扶正化瘀膠囊、復(fù)方鱉甲軟肝片等顯示出了較好的療效,提示中醫(yī)藥可能成為抗肝纖維化的優(yōu)先選擇。
　　花芝肝泰(HZGT)膠囊是由靈芝、五味子等中藥組成的復(fù)方制劑,臨床應(yīng)用治療肝硬化亦取得較好的療效,但其藥理作用特點(diǎn)、作用機(jī)理和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)均不清楚。因此,本課題建立并優(yōu)化了CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型和ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷模型,觀察了花芝肝泰對模型的治療

4、作用并對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。
　　一、CCl4致肝纖維化模型的建立
　　肝纖維化動物模型按成因不同可分為化學(xué)性毒物誘導(dǎo)模型,免疫性肝損傷模型、膽汁淤積性肝纖維化模型等。其中化學(xué)毒物四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型是使用最廣泛的肝纖維化模型,具有和人類肝纖維化相似的病理改變以及簡便易行等特點(diǎn)。其原理是 CCl4在肝細(xì)胞微粒體氧化酶的作用下生成三氯化碳自由基攻擊肝細(xì)胞,引

5、起肝細(xì)胞的壞死,反復(fù)用CCl4攻擊引起慢性炎癥而導(dǎo)致肝纖維化的形成。該模型的成模時間、成模率、死亡率文獻(xiàn)報導(dǎo)很不一致,根據(jù)CCl4的給予量、給藥途徑、動物品系的改變而有所不同。
　　本研究主要對 CCl4的劑量、給藥途徑和動物種屬等造模條件對模型的成模率和死亡率的影響進(jìn)行了考察。
　　考察劑量時,CCl4設(shè)定0.5、0.75、1.0 ml/kg三個劑量,采用腹腔注射進(jìn)行,2次/周,共8周,于第9周開始停止注射CCl4,觀察至

6、第12周;考察給藥途徑時采用相同劑量的CCl4腹腔注射或灌胃,2次/周,共12周;考察動物種屬時,選擇ICR小鼠和SD大鼠,相同劑量的CCl4灌胃,2次/周,共12周。觀察動物的體重、血清ALT、TP、ALB、HA和生存曲線隨造模時間的變化,采用蘇木精-伊紅和馬松三色染色觀察肝臟病理改變。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,選用不同劑量的CCl4腹腔注射后,在第10周,0.5 ml/kg CCl4造模僅在匯管區(qū)形成纖維化,0.75 ml/kg C

7、Cl4則形成了纖維間隔,而1 ml/kg CCl4造模形成的纖維間隔將肝臟分割成塊,即晚期肝纖維化(advanced liver fibrosis),提示合適的CCl4劑量為1 ml/kg。灌胃和腹腔注射的給藥途徑均能導(dǎo)致明顯的肝纖維化,其中灌胃方式造模死亡率在10％以下,而腹腔注射方式造模死亡率在60％以上,說明灌胃造模動物耐受性較好。大鼠和小鼠應(yīng)用CCl4后,血清 ALT均在第4周出現(xiàn)高峰,之后稍微下降,接著持續(xù)升高;血清HA則在第

8、6周開始升高,至12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時仍在繼續(xù)升高。造模12周時大鼠肝纖維化評分高于小鼠,說明大鼠模型的病理改變較小鼠模型更嚴(yán)重。以上結(jié)果提示大鼠和小鼠肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中各項(xiàng)指標(biāo)的變化趨勢類似,均可以用于抗肝纖維化藥物的篩選和評價。
　　二、HZGT療效的觀察
　　通過第一部分的研究,確立了CCl4肝纖維化模型的造模方法為1ml/kg CCl4灌胃給藥。在此基礎(chǔ)上,觀察了HZGT對小鼠模型的療效。結(jié)果顯示,肝纖維化小鼠體重的增

9、長受到抑制,血清ALT和HA明顯升高,肝纖維化病理評分為為2.7±1.2。HZGT對肝纖維化小鼠體重增長的抑制沒有明顯改善,能在造模第5周和第11周顯著降低肝纖維化小鼠血清ALT,能在第12周顯著降低其血清HA,減少肝纖維化小鼠肝臟的纖維化病理評分,以上結(jié)果說明HZGT對CCl4所致的小鼠肝纖維化具有明顯的治療作用。
　　進(jìn)而在大鼠模型上進(jìn)一步觀察了HZGT的療效。結(jié)果顯示,肝纖維化大鼠體重的增長受到明顯的抑制,血清 ALT、HA

10、和LN明顯升高,肝纖維化評分為4.0±0.0。HZGT能夠促進(jìn)肝纖維化大鼠體重的增長,能在第8周和第10周顯著降低其血清ALT,能在第10周顯著降低其血清HA和LN,減少其肝臟膠原的沉積和組織病理評分,以上結(jié)果說明HZGT對CCl4所致大鼠肝纖維化具有明顯的治療作用。
　　上述研究表明,HZGT對 CCl4所誘導(dǎo)的肝纖維化具有明顯的治療作用。由于我國的肝纖維化主要是由乙肝病毒引起的免疫性肝炎遷延不愈造成的,ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷

11、和病毒引起的爆發(fā)性肝炎有相似的特征。本研究進(jìn)一步考察HZGT對ConA誘導(dǎo)的免疫性肝炎的作用。結(jié)果顯示高劑量的HZGT能夠顯著地降低模型小鼠血清 ALT,提示 HZGT對免疫性肝炎具有保護(hù)作用。至于 HZGT對ConA誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型是否有治療作用,尚需進(jìn)一步研究。
　　三、HZGT作用機(jī)制的研究
　　目前的研究表明,HSC處于肝纖維化的中心環(huán)節(jié),是細(xì)胞外基質(zhì)的主要產(chǎn)生細(xì)胞,TGF-b1是促進(jìn)HSC產(chǎn)生膠原最強(qiáng)的細(xì)胞

12、因子。
　　因此本部分研究首先在整體動物模型上考察了HZGT對肝纖維化小鼠血清TGF-b1的作用。結(jié)果顯示,HZGT能夠劑量依賴性的降低肝纖維化小鼠血清中TGF-b1的含量。以上結(jié)果提示,HZGT可能能夠影響HSC的增殖和膠原的產(chǎn)生。
　　進(jìn)而在細(xì)胞水平上考察了HZGT對肝星形細(xì)胞系LX-2細(xì)胞增殖、形態(tài)和凋亡的影響。結(jié)果顯示,HZGT含藥血清能夠促進(jìn) LX-2細(xì)胞的生長,改變 LX-2細(xì)胞的形態(tài),降低LX-2細(xì)胞的存活率,

13、增加LX-2細(xì)胞的凋亡。以上結(jié)果提示TGF-b1→HSC通路是HZGT抗肝纖維化的途徑之一。
　　通過以上研究,本論文主要得到以下結(jié)論:
　　1、通過對 CCl4造模劑量、造模途徑及動物種屬進(jìn)行考察,確定 CCl4合適的造模劑量為1.0 ml/k,造模途徑宜選灌胃方式,大鼠和小鼠模型肝纖維化的各項(xiàng)指標(biāo)變化趨勢一致,均可用于抗肝纖維化藥物的篩選和評價。
　　2、HZGT能降低肝纖維化小鼠血清 ALT、HA值及肝臟的膠原沉

14、積和肝纖維化病理評分,說明 HZGT對 CCl4所致小鼠肝纖維化具有明顯改善作用。
　　3、HZGT能減輕CCl4所致肝纖維化大鼠體重的降低,并能降低肝纖維化大鼠血清ALT、HA和LN值及肝臟的膠原沉積和肝纖維化病理評分,說明對 CCl4所致大鼠肝纖維化具有明顯改善作用。
　　4、HZGT能降低ConA誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠血清ALT活力,提示HZGT對免疫性肝炎具有保護(hù)作用。
　　5、HZGT能夠劑量依賴性地降低肝纖維