中藥肝復康治療大鼠肝纖維化的實驗研究.pdf

1、背景和目的:該研究采用雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,皮下注射四氯化碳誘發(fā)肝纖維化模型,分別以中藥肝復康膠囊(高、中、低三種劑量)、秋水仙堿及肝脾康干預.光鏡觀察肝小葉結構、肝細胞變性及炎性浸潤情況;電鏡觀察肝細胞超微結構改變;偏振光顯微鏡觀察基質(zhì)膠原纖維沉積情況及膠原成分分析;血清檢測酶學及肝臟功能以評估肝復康療效.免疫組化檢測細胞因子TGF-β<,1>及層粘連蛋白(LN)的表達;RT-PCR測定基質(zhì)金屬蛋白酶(明膠酶-

2、A/MMP-2)和金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)的基因表達來探討肝復康抗肝纖維化部分可能的機制.同時采用超聲組織定征技術對正常及不同程度纖維化大鼠肝臟的背向散射積分進行測定,旨在探討超聲組織定征技術在肝纖維化中的應用價值.方法:大連醫(yī)科大學動物中心提供雌性SD大鼠90只,體重100---150克,室溫20℃,自然晝夜,自由飲水攝食.利用四氯化碳皮下注射法(10﹪CCl<,4>,5ml/kg,每周兩次,共13周)制備肝纖維化模型,實

3、驗動物隨機分為7組:正常組、模型組、肝復康高劑量組、中劑量組、低劑量組、秋水仙堿組、肝脾康組.藥物治療從造模60天后開始,正常對照組與上述各組每日經(jīng)口分別灌服生理鹽水、生理鹽水、高劑量肝復康(3.125g/kg)、中劑量肝復康(0.3125g/kg)、低劑量肝復康(0.03125g/kg)、秋水仙堿(1mg/kg)、肝脾康(0.55g/kg),藥物的劑量根據(jù)體表面積的公式進行換算,每千克體重用量為正常成人用量的6.25倍.按10ml/k

4、g體重灌服,治療時間為60天.在最后一次給藥24小時后,經(jīng)乙醚麻醉內(nèi)眥采血檢測各項指標,并取肝左葉作為檢測標本.賴氏法測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性,采用溴甲酚綠比色法和考馬斯亮藍比色法測定血清白蛋白、總蛋白及白球蛋白比,比色法測定血清羥脯氨酸(Hyp)及血清唾液酸(SA),消化法測定肝組織羥脯氨酸,免疫組化方法檢測肝組織LN、TGF-β<,1>表達,光鏡觀察肝小葉結構、肝細胞變性及炎性浸潤情況,電鏡觀察肝細胞超

5、微結構改變,苦味酸-天狼猩紅染色在偏振光顯微鏡觀察基質(zhì)膠原纖維沉積情況及Image-Pro圖像分析系統(tǒng)分析Ⅰ、Ⅲ型膠原面積及其比值情況,RT-PCR測定基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)和金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)的基因表達.采用HP5500型彩超儀,S<,4>超寬變頻相控陣探頭,探頭頻率2—4MHz進行大鼠肝臟的背向散射積分定量分析.數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析、單因素相關分析及成組設計秩和檢驗(

6、等級資料),以p<0.05為顯著性檢驗界限.結論:1.四氯化碳造模后大鼠呈現(xiàn)較重程度的肝纖維化,肝功能嚴重受損.同時其他檢測顯示肝組織TGF-β<,1>、LN及MMP-2和TIMP-1表達增強.2.肝復康干預后,肝組織形態(tài)學、肝功能及血清指標均說明肝復康對實驗性肝纖維化有明確的治療作用,其效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)西藥秋水仙堿和中藥肝脾康.中劑量組對肝纖維化的治療作用較為明顯,是較為合理的用藥劑量.3.肝復康抗肝纖維化機制可能為:保護肝細胞,減輕