Wnt-β-catenin信號(hào)通路在肝纖維化中的作用及中藥肝復(fù)康的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的:
　　 慢性肝損傷引起肝纖維化,最終導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌,已成為世界范圍內(nèi)的一類重大疾病。肝纖維化十分復(fù)雜的病理過(guò)程,其本質(zhì)是肝星狀細(xì)胞(hepaticstellate cells,HSCs)的活化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過(guò)度沉積。國(guó)內(nèi)外的研究均證明肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的,有效的治療肝纖維化可以防止各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展。正常情況下肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)致肝病因子造成肝

2、細(xì)胞損傷時(shí),經(jīng)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使肝星狀細(xì)胞激活,并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,即導(dǎo)致HSC的活化?；罨腍SC的主要特征包括HSC增殖和HSC內(nèi)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá)。因此,研究肝纖維化的發(fā)生機(jī)制,有效阻止HSC的增殖和活化是治療和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重大課題。
　　 Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一種對(duì)細(xì)胞增殖和分化等多種功能具有重要調(diào)節(jié)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),涉及到胚胎生長(zhǎng),組織細(xì)胞增殖,維持

3、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等多種生命活動(dòng)過(guò)程,是一個(gè)由多種分子參與、互相影響互相制約的復(fù)雜體系。目前,Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常與腫瘤及多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),成為分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤研究的熱點(diǎn)。研究證實(shí)的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有4條,分別為:經(jīng)典的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(又稱為Wnt/β-catenin通路);Wnt/Ca2+通路;平面的細(xì)胞極性通路(Planar cell polarity pathway,PCP)又稱Wnt/JNK通路;調(diào)節(jié)紡錘體

4、定向和不對(duì)稱細(xì)胞分裂的通路。其中Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前研究比較多、比較深入的一條分支。
　　 近年來(lái),肝纖維化的治療并沒(méi)有取得顯著進(jìn)展,西藥由于抗纖維化作用靶位單一,療效并不理想,而且有些藥物的毒副作用大于治療作用,不宜用于臨床,因此,中醫(yī)藥抗肝纖維化治療研究現(xiàn)正受到世界肝病學(xué)界的廣泛重視。大量的臨床試驗(yàn)和動(dòng)物模型已證實(shí)中藥肝復(fù)康具有改善肝功、減輕炎癥、抑制纖維增生等功能,但其具體治療機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。<

5、br>　　 本課題采用CCL4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的動(dòng)物模型,培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞HSC-T6,觀察:1)中藥肝復(fù)康對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響;2)經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化動(dòng)物模型中的作用及中藥肝復(fù)康對(duì)它的影響;3)中藥肝復(fù)康藥物血清對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)作用。
　　 方法:
　　 健康的SD大鼠(雌雄不限),體重

6、180-220克,清潔級(jí),由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。正常喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C),模型組(M),低劑量治療組(LT)、中劑量治療組(MT)、高劑量治療組(HT)。除正常對(duì)照組外,余鼠造模。皮下注射以橄欖油稀釋的10％的四氯化碳,5ml/kg,每周兩次,共12周,正常對(duì)照組以同樣方法皮下注射生理鹽水。高、中、低劑量治療組則于造模第9周后開(kāi)始分別以3125mg/kg·d、312.5mg/kg·d、31.25mg/kg·d劑

7、量的肝復(fù)康灌胃至20周。以上各劑量藥物均溶于10ml/kg的生理鹽水中。于12周末處死模型組,第20周末處死其他各組,取肝組織稱取肝臟濕重,從肝右葉的中部切取2塊肝組織,一塊用10%的甲醛固定后制備石蠟切片,另一塊于-70℃冰箱保存用于分子生物學(xué)檢測(cè)。HE染色來(lái)反映肝纖維化的程度,雙盲發(fā)采用Isak評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)分。
　　 大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)細(xì)胞株由上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所徐列明教授惠贈(zèng),中劑量藥物血清

8、依照既定工藝制備。
　　 免疫組化法觀察大鼠肝組織中TIMP-1,Tcf-4,α-SMA和β-catenin的表達(dá);反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測(cè)大鼠肝組織和肝星狀細(xì)胞中Wnt1,Wnt3a,Wnt10b,Frizzled-1,Frizzled-2,GSK-3B,β-catenin,Tcf-4,CyclinD1,PPARγ

9、,α-SMA,CollagenⅠ,CollagenⅢ,MMP2,TIMP-1的表達(dá)水平。免疫蛋白印跡(Western-Blot)方法檢測(cè)β-catenin,Tcf-4,α-SMA,CollagenⅠ,TIMP-1在大鼠肝組織和肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)表示,采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),然后用LSD法進(jìn)行兩兩比較。用Pearson方法進(jìn)行相關(guān)分析。P＜0

10、.05為差異有意義,P＜0.01為差異有顯著性意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 一、中藥肝復(fù)康對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 1.HE肝臟組織病理學(xué)染色結(jié)果顯示:與正常組肝組織相比,模型組大鼠可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,大量纖維組織增生,假小葉形成,肝細(xì)胞腫大,脂肪變性明顯,部分有壞死;與模型組相比,肝復(fù)康高、中、低劑量治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改善,肝細(xì)胞水腫好轉(zhuǎn),脂肪變性明顯改善,膠

11、原纖維增生明顯減輕,其中中劑量治療組(312.5mg/kg/d)治療效果明顯優(yōu)于其它兩組。
　　 2.中藥肝復(fù)康對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 免疫組化結(jié)果顯示,正常組α-SMA和TIMP-1表達(dá)量很少;模型組肝組織可見(jiàn)大量的α-SMA和TIMP-1陽(yáng)性染色;與模型組相比,肝復(fù)康高、中、低劑量治療組陽(yáng)性表達(dá)明顯減少,其中中劑量治療組效果最佳。
　　 Western-Blot結(jié)果顯示α-SMA,Collage

12、nⅠ,TIMP-1在正常組表達(dá)很少或幾乎不表達(dá),模型組三者的表達(dá)明顯高于正常組(p＜0.01),肝復(fù)康治療組三者表達(dá)均明顯下調(diào)。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,與正常組相比,CCL4刺激的模型組α-SMA,CollagenⅠ,CollagenⅢ。MMP2,TIMP-1mRNA表達(dá)水平顯著增加(p＜0.01);與模型組相比,肝復(fù)康治療組這些基因的表達(dá)均下調(diào),以中劑量治療組下調(diào)最為明顯。
　　 二、經(jīng)典的Wnt/β-caten

13、in信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化動(dòng)物模型中的作用及中藥肝復(fù)康對(duì)它的影響
　　 1.經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的Wnt配體Wnt1,Wnt3a,Wnt10b在CCL4刺激的模型組表達(dá)明顯高于正常組(p＜0.05),肝復(fù)康干預(yù)可以緩解上述變化;Wnt受體Frizzled-1,Frizzled-2也具有類似的變化。
　　 2.免疫組化和RT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中β-catenin和轉(zhuǎn)錄因子TCF-4在模型組中的表達(dá)明顯高于

14、正常組,肝復(fù)康治療可以下調(diào)β-catenin的表達(dá);而GSK-3β則表現(xiàn)為相反的結(jié)果。
　　 Western-Blot結(jié)果顯示,正常組細(xì)胞核內(nèi)幾乎不表達(dá)β-catenin,而模型組β-catenin在胞漿和胞核均發(fā)生明顯的積累。
　　 3.經(jīng)典Wnt信號(hào)通路下游的靶基因CyclinD1在模型組的表達(dá)均高于正常組(p＜0.05),使用肝復(fù)康治療后,二者表達(dá)明顯減弱;PPARγ呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。
　　 4.經(jīng)典Wnt信

15、號(hào)通路中的關(guān)鍵因子與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性分析顯示二者呈顯著正相關(guān)。
　　 三、中藥肝復(fù)康藥物血清對(duì)肝星狀細(xì)胞HSC-T6中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)作用。
　　 1.與正常組相比,乙醛刺激的模型組HSC細(xì)胞α-SMA,CollagenⅠ,CollagenⅢ,MMP2和TIMP-1的表達(dá)明顯升高,用肝復(fù)康中劑量藥物血清干預(yù)后,這些基因的表達(dá)顯著下降。
　　 2.經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的

16、主要組分Wnt1,Wnt3a,Wnt10b,Frizzled-1,Frizzled-2,β-catenin和TCF-4在模型組的表達(dá)均明顯上調(diào),而GSK-3β的表達(dá)則降低,使用肝復(fù)康中劑量藥物血清干預(yù)后,能明顯改善上述變化。
　　 3.經(jīng)典Wnt信號(hào)通路下游的靶基因CyclinD1在模型組的表達(dá)均高于正常組,使用肝復(fù)康中劑量藥物血清干預(yù)后,二者表達(dá)明顯減弱;PPARγ則呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。
　　 4.經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中