SB216763和肝復(fù)康干預(yù)下的肝星狀細(xì)胞中Wnt-β-catenin與Wnt-Ca2+信號(hào)通路之間的相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　肝纖維化是多種慢性肝臟病變最終進(jìn)展到肝硬化的一個(gè)重要中間過(guò)程，以肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracel lular matrix，ECM)的大量沉積為主要特征。研究證實(shí)，Wnt信號(hào)通路在肝纖維化的過(guò)程當(dāng)中起到了重要的作用，其中以Wnt/β-catenin研究的最多。中藥肝復(fù)康是我校病理生理教研室經(jīng)多年實(shí)驗(yàn)總結(jié)出的抗肝纖維化的經(jīng)驗(yàn)方，已證實(shí)對(duì)Wnt/β-cat

2、enin通路和非經(jīng)典的Wnt/Ca2+信號(hào)通路均有抑制作用。目前，在對(duì)腫瘤一些的研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt/Ca2+信號(hào)通路能夠?qū)nt/β-catenin通路起到抑制的作用，即說(shuō)明了這兩條通路在有些腫瘤中并不是單一的產(chǎn)生作用，而兩條通路之間也是可能存在某種相互關(guān)系，能夠相互影響，但在對(duì)肝纖維化的研究中則主要研究的是每條通路與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展可能存在的某些機(jī)制，但對(duì)這兩條通路之間的相互關(guān)系卻還不十分明確。SB216763是GSK-3β的抑制劑

3、，使胞漿中β-catenin大量累積并入核，從而激活Wnt/β-catenin通路。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用中藥肝復(fù)康藥物血清和SB216763干預(yù)培養(yǎng)的HSC，然后分析在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Wnt/β-catenin通路與Wnt/Ca2+信號(hào)通路之間的相互關(guān)系。
　　方法:
　　用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5％CO2混合氣體、37℃的孵箱中培養(yǎng)，傳代大鼠HSC-T6細(xì)胞株。待細(xì)胞條件成熟后，再用不含血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓

4、培養(yǎng)24h后分組加藥。
　　在六孔板中將細(xì)胞隨機(jī)的分為以下五組:正常血清組（含10％正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）;SB21676320μM組（含10％正常大鼠血清，SB2167632umol/L的DMEM培養(yǎng)基）;SB21676310μM組（含10％正常大鼠血清，SB2167631umol/L的DMEM培養(yǎng)基）:肝復(fù)康治療組（含10％肝復(fù)康治療組大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）;SB21676320μM加肝復(fù)康治療組（SB216763

5、20μM基礎(chǔ)上用10％肝復(fù)康藥物血清干預(yù)），用孵箱在37℃，5％CO2混合氣體的環(huán)境中培養(yǎng)48h。
　　逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測(cè)HSC細(xì)胞中collagenⅠ，collagenⅢ，a-SMA的表達(dá)和Wnt/Ca2+信號(hào)通路中的相關(guān)指標(biāo)Wnt5a， Frizzled2，CAMKⅡ，MPP-7 mRNA相對(duì)表達(dá)量，免疫蛋白

6、印跡法(western blot)檢測(cè)細(xì)胞中MPP-7的蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。
　　結(jié)果:
　　1、SB216763與肝復(fù)康對(duì)大鼠HSC-T6細(xì)胞活性及a-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原的影響
　　1.1 RT-PCR檢測(cè)SB216763對(duì)大鼠HSC-T6細(xì)胞活性及a-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原的影響
　　SB21676310μM與SB21676320μM組HSC明顯活化，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原

7、、a-SMA表達(dá)量與正常血清組相比顯著增加，其中又以SB21676320μM組增多的更為明顯，說(shuō)明使用SB216763后HSC-T6細(xì)胞株有明顯的纖維化傾向。
　　1.2 RT-PCR檢測(cè)肝復(fù)康對(duì)HSC-T6中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、a-SMA表達(dá)的影響
　　肝復(fù)康藥物血清組與SB21676310μM、SB21676320μM組相比，HSC細(xì)胞中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、a-SMA的表達(dá)量顯著減少，同時(shí)SB21676320μM加肝復(fù)康

8、血清組與SB21676320μM組相比，三者的表達(dá)量均有所減少，說(shuō)明肝復(fù)康能夠有效的抑制Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、a-SMA在HSC-T6細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　2、SB216763和肝復(fù)康對(duì)HSC-T6細(xì)胞株中Wnt/Ca2+信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響
　　2.1 RT-PCR檢測(cè)Wnt/Ca2+信號(hào)通路中Wnt5a的mRNA表達(dá)
　　Wnt5a是Wnt/Ca2+信號(hào)通路是一種重要的起始蛋白，在正常大鼠肝臟細(xì)胞中含量很少，幾

9、乎不表達(dá)。雖然Wnt與不同的受體結(jié)合后，能夠激活不同的Wnt通路，包括經(jīng)典Wnt通路，但在本實(shí)驗(yàn)中，Wnt經(jīng)典通路激活后，通過(guò)RT-PCR顯示，各組Wnt5a的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2 RT-PCR檢測(cè)Wnt/Ca2+信號(hào)通路中Frizzed2的mRNA表達(dá)
　　Frizzed2是Wnt信號(hào)通路的中一種跨膜受體蛋白， Wnt5a與其結(jié)合后激活Wnt/Ca2+信號(hào)通路，在正常大鼠肝臟

10、細(xì)胞中表達(dá)很少，幾乎不表達(dá)。通路RT-PCR測(cè)其在SB21676320μM、10μM、肝復(fù)康藥物血清治療組、肝復(fù)康加SB216763的mRNA相對(duì)表達(dá)量與正常血清對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。
　　2.3 RT-PCR檢測(cè)Wnt/Ca2+信號(hào)通路中CAMKⅡ的mRNA表達(dá)
　　CAMKⅡ是Wnt/Ca2+信號(hào)途徑下游一種關(guān)鍵的蛋白激酶，在正常大鼠肝臟細(xì)胞表達(dá)微量，幾乎不表達(dá)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)CAMKⅡ在各組的mRNA相對(duì)表達(dá)量，

11、發(fā)現(xiàn)與正常血清對(duì)照組相比沒(méi)有表達(dá)差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)差異性，說(shuō)明在使用SB216763后，Wnt/Ca2+信號(hào)途徑可能沒(méi)有受到Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的影響而發(fā)生相應(yīng)的改變。
　　2.4 RT-PCR檢測(cè)Wnt/Ca2+信號(hào)通路MMP-7的mRNA表達(dá)
　　MMP-7在正常大鼠肝臟細(xì)胞中表達(dá)很少，幾乎不表達(dá)。在RT-PCR檢測(cè)結(jié)果中，雖然與正常血清對(duì)照組相比，SB21676320μM組中的mRAN表達(dá)相對(duì)量增加，但是差異沒(méi)

12、有有顯著性。在其它三組SB21676310μM、肝復(fù)康藥物血清組及肝復(fù)康加SB21676320μM中的mRNA相對(duì)表達(dá)量均無(wú)明顯變化。
　　3 Western-blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　MPP-7在正常肝臟組織細(xì)胞很少表達(dá)，幾乎不表達(dá)。與正常血清組相比SB21676320μM增多較為明顯，10μM及肝復(fù)康、肝復(fù)康加SB216763組表達(dá)則無(wú)明顯差別，且表達(dá)均不明顯，與RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，這可能與其復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。