激活WNT-β-Catenin信號(hào)通路促進(jìn)梗阻性黃疸大鼠肝再生的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　在肝膽胰外科領(lǐng)域，梗阻性黃疸(Obstructive jaundice，OJ)是患者就診最常見(jiàn)的原因之一。伴有淤膽的肝臟疾病，如肝門部膽管癌、膽管囊狀擴(kuò)張癥、膽石癥等需要行肝臟部分切除術(shù)進(jìn)行治療。然而伴有黃疸的肝臟行大范圍肝切除時(shí)術(shù)后并發(fā)癥高，并存在肝功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，這已成為肝膽外科亟待解決的重要基礎(chǔ)性問(wèn)題。既往研究表明這與殘肝功能體積不足和再生能力下降有關(guān)。雖然目前對(duì)正常肝臟再生的機(jī)制有了一定了解，但是黃疸狀態(tài)下影響

2、肝再生的機(jī)制仍未闡明，特別是分子機(jī)制仍然模糊。臨床上處理方法主要是術(shù)前的引流，術(shù)中的損傷控制手術(shù)以及術(shù)后的護(hù)肝治療，雖然取得了一定療效，但仍然是一種被動(dòng)性的治療，還存在一定的局限性，例如長(zhǎng)時(shí)間的引流貽誤了手術(shù)時(shí)機(jī)，內(nèi)引流引起膽道感染和胰腺炎發(fā)作，一些膽管不擴(kuò)張的淤膽和輕中度的黃疸水平如何制定肝切除手術(shù)規(guī)劃等等。上述這些方法均未從根本機(jī)制上改善黃疸對(duì)肝再生的影響。因此研究黃疸狀態(tài)下肝再生的分子機(jī)制，對(duì)于改變目前這種被動(dòng)的“期待”治療，完善

3、伴有黃疸的肝切除術(shù)的治療體系有重要的臨床意義。
　　隨著組學(xué)研究和生物信息學(xué)的發(fā)展，文獻(xiàn)已報(bào)道通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選得到與肝再生相關(guān)的若干信號(hào)通號(hào)，為了了解這些通路是否在OJ狀態(tài)下也參與肝再生的過(guò)程，我們經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出在OJ大鼠肝切除術(shù)后肝再生過(guò)程中同樣發(fā)揮重要作用的Wnt/β-Catenin信號(hào)通路進(jìn)行研究。既往在正常大鼠70％肝切除模型中已經(jīng)證明，Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在肝再生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但在OJ狀態(tài)下，

4、Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在肝再生過(guò)程中如何發(fā)揮作用，肝再生受到抑制是否與Wnt/β-Catenin信號(hào)通路有關(guān)這些問(wèn)題尚未明確，相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。因此本文在建立改良的大鼠OJ后肝切除+內(nèi)引流的模型基礎(chǔ)上，觀察OJ對(duì)肝再生的影響和變化規(guī)律，研究Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在黃疸條件下對(duì)肝再生的作用，探索黃疸對(duì)肝再生的影響的分子機(jī)制。
　　第一部分結(jié)合顯微外科技術(shù)改良大鼠梗阻性黃疸后肝切除+內(nèi)引流模型
　　目的:

5、為了更好地研究黃疸的病理生理機(jī)制，既往已經(jīng)建立了多種大鼠梗阻性黃疸后肝切除+內(nèi)引流模型，但膽管堵塞、膽道感染等并發(fā)癥仍常見(jiàn)，術(shù)后死亡率高，影響了模型的穩(wěn)定性。本研究利用顯微外科技術(shù)，建立改良的大鼠OJ后肝切除+內(nèi)引流模型，評(píng)估改良模型的穩(wěn)定性和安全性，為研究OJ對(duì)肝臟再生的影響提供穩(wěn)定的模型保證。
　　方法:在建立大鼠OJ的基礎(chǔ)上，改良了肝切除術(shù)后內(nèi)引流的方法，將傳統(tǒng)的擴(kuò)張近端膽管與十二指腸內(nèi)引流改良為近端擴(kuò)張膽管與遠(yuǎn)端胰腺段膽管

6、內(nèi)支架引流的方法。所有的操作均在顯微鏡下完成。改良的具體方法如下:第一次手術(shù)結(jié)扎并切斷膽總管，建立梗阻性黃疸模型。7天后進(jìn)行第二次手術(shù)，用特制引流管將胰腺段膽總管與擴(kuò)張近端膽總管連接建立膽管—膽管內(nèi)引流，然后行70％肝切除。實(shí)驗(yàn)采用健康成年雄性SD大鼠，體重240-280g。根據(jù)手術(shù)方法不同將大鼠隨機(jī)分為4組。Group1(G1):為假手術(shù)組，開腹后，游離膽總管但不做任何處理后關(guān)腹;Group2(G2):建立OJ7天后，行傳統(tǒng)的近端擴(kuò)張

7、膽道—十二指腸內(nèi)引流+70％肝切除;Group3(G3):非顯微鏡下建立OJ，7天后采用改良的擴(kuò)張近端膽道—膽道內(nèi)引流+70％肝切除模型，全程均不使用顯微鏡;Group(G4):全顯微鏡下建立OJ，7天后采用改良的膽道—膽道內(nèi)引流+70％肝切除模型。觀察術(shù)后手術(shù)并發(fā)癥和死亡率，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，在術(shù)后1h、6h、12h、1d、3d、7d、10d、14d時(shí)間乙醚麻醉下處死大鼠抽血并取材，比較各組生化指標(biāo)、肝臟病理

8、改變，評(píng)估新型模型的穩(wěn)定性和安全性。
　　結(jié)果:三種OJ建模方法成功率分別為G286.3％，G388.8％，G497.5％(P＜0.05)，膽瘺和漏扎尾狀葉膽管是造模失敗的主要原因。OJ7天后行內(nèi)引流+肝切除，G2、G3、G4三組早期肝臟功能快速恢復(fù)，7天后G4組肝功能最為穩(wěn)定。術(shù)后兩周并發(fā)癥分別是G220％，G311.8％，G46.25％(P＜0.05)，三組的生存率分別為G260.0％，G368.8％，G492.0％(P＜0.

9、05)。術(shù)后早期G3組與G4組淀粉酶一過(guò)性升高，G3組與G2組比較差異有顯著性(P＜0.05)，G4組與G2組比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。
　　結(jié)論:結(jié)合顯微外科技術(shù)，改良的大鼠OJ后肝切除+內(nèi)引流模型手術(shù)創(chuàng)傷小，術(shù)后并發(fā)癥低，術(shù)后生存率高，模型的穩(wěn)定性和安全性優(yōu)于傳統(tǒng)方法，是膽道內(nèi)引流相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的理想模型。
　　第二部分梗阻性黃疸對(duì)大鼠肝再生的影響及與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系
　　目的:建立大

10、鼠OJ后肝切除+內(nèi)引流的肝臟再生模型，觀察OJ后對(duì)肝再生的影響和變化規(guī)律，研究與肝臟再生相關(guān)的Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在黃疸條件下對(duì)肝再生的作用，為探索黃疸對(duì)肝再生影響的分子機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法:動(dòng)物隨機(jī)分為三組，分別為假手組、對(duì)照組（非梗黃70％肝切除）和實(shí)驗(yàn)組（梗黃后70％切除）。每組分六個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，分別為術(shù)后1h、6h、12h、24h、72h和168。觀察比較三組之間血清生化指標(biāo)變化、肝重體重比、肝臟再生率，

11、免疫組織化學(xué)法計(jì)算肝臟Ki-67和PCNA標(biāo)記指數(shù)。Western blot法檢測(cè)肝組織中Wnt/β-Catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá);qRT-PCR法檢測(cè)Wnt/β-Catenin通路相關(guān)基因在肝臟的表達(dá)。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組術(shù)后均全部存活，實(shí)驗(yàn)組ALT和AST在術(shù)后1h、6h、12h和24h均高于對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組Alb在術(shù)后24h、72h和168h均低于對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組的肝體重比和肝再生率在72

12、h和168h均低于對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組的Ki-67標(biāo)記指數(shù)和PCNA標(biāo)記指數(shù)在12h、24h和72h均低于對(duì)照組(P＜0.05);western blot分析β-catenin在對(duì)照組6h表達(dá)量開始增加，在術(shù)后24h-72h達(dá)高峰，而在實(shí)驗(yàn)組β-catenin的表達(dá)在術(shù)后12h才開始增加，較對(duì)照組延遲，但無(wú)明顯的表達(dá)高峰。對(duì)照組中cyclin D1和cyclin E1蛋白在術(shù)后12h開始高表達(dá)，持續(xù)至術(shù)后72h，而實(shí)驗(yàn)組中蛋白

13、表達(dá)24h開始，表達(dá)高峰較對(duì)照組延遲;qRT-PCR分析對(duì)照組中cyclin D1和cyclin E1在術(shù)后6h表達(dá)量開始升高，在24h和72h達(dá)到高峰，而實(shí)驗(yàn)組mRNA表達(dá)在術(shù)后24h開始升高。實(shí)驗(yàn)組cyclin D1和cyclin E1的基因表達(dá)在12h、24h和72h均低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:梗阻性黃疸行肝切除后肝臟再生受到明顯抑制，表現(xiàn)為肝再生延遲，與Wnt/β-Catenin信號(hào)通路受抑制，β-Caten

14、in表達(dá)受抑制有關(guān)。
　　第三部分Wnt激動(dòng)劑對(duì)梗阻性黃疸大鼠肝切除術(shù)后肝臟的保護(hù)性作用及機(jī)制
　　目的:我們?cè)诘诙糠盅芯恐邪l(fā)現(xiàn)，OJ使大鼠肝切除后肝再生延遲，與Wnt/β-catenin信號(hào)通路受抑制，β-catenin低表達(dá)有關(guān)。因此在本部分研究我們?cè)贠J大鼠肝切除術(shù)前通過(guò)外源性藥物激活Wnt/β-catenin通路，觀察肝切除術(shù)后肝再生變化，并探討其分子機(jī)制。
　　方法:雄性SD大鼠被隨機(jī)分為3組。Group1

15、(G1):為假手術(shù)組，大鼠只進(jìn)行開腹和關(guān)腹處理;Group2(G2):為對(duì)照組，OJ7天后行內(nèi)引流+70％肝切除前，腹腔注射0.9％生理鹽水;Group3(G3):為治療組，大鼠在梗阻性黃疸7天后行內(nèi)引流和70％肝切除，肝切除前腹腔注射 Wnt激動(dòng)劑[(2-amino-4-[3,4-(methylenedioxy)benzylamino]-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine)],5mg/kg。大鼠在術(shù)后1h，6h

16、，12h，24h，72h和168h6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材。觀察比較三組之間術(shù)后肝損傷、肝臟再生變化，Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組術(shù)后的肝功能和肝臟的再生相關(guān)指數(shù)均好于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組ALT和AST在術(shù)后6h、12h和24h均低于對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組TBIL在術(shù)后12h和24h均低于對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組Alb在術(shù)后72h和168h均高于對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組的肝體重比

17、和肝再生率在72h和168h均高于對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組的Ki-67標(biāo)記指數(shù)和PCNA標(biāo)記指數(shù)在24h和72h均高于對(duì)照組(P＜0.05);western blot分析β-catenin在實(shí)驗(yàn)組6h開始表達(dá)量開始增加，在術(shù)后24-72h達(dá)高峰，而在對(duì)照組β-catenin的表達(dá)在術(shù)后12h才開始增加，較實(shí)驗(yàn)組延遲，但無(wú)明顯的表達(dá)高峰。實(shí)驗(yàn)組中cyclin D1和cyclin E1蛋白在術(shù)后12h開始高表達(dá)，持續(xù)至術(shù)后72h，而對(duì)

18、照組中蛋白表達(dá)24h開始，表達(dá)高峰較對(duì)照組延遲;qRT-PCR分析實(shí)驗(yàn)組中cyclinD1和cyclinE1在術(shù)后6h表達(dá)量開始升高，在24h和72h達(dá)到高峰，而對(duì)照組cyclin D1和cyclin E1在術(shù)后24h表達(dá)量開始升高，實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)在12h、24h和72h均高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:梗阻性黃疸大鼠肝切除術(shù)后肝再生延遲啟動(dòng)與wnt/β-catenin信號(hào)通路受抑制有關(guān)，通過(guò)激活wnt/β-catenin