Wnt-β-catenin信號通路在大鼠哮喘氣道重塑中的作用及其調控.pdf

1、目的：
　　1.通過檢測Wnt5a、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、蓬亂蛋白(Dishevelled, Dvl)-1的表達情況，研究Wnt/β-catenin信號通路在哮喘氣道重塑中的作用;
　　2.探討c-Myc、細胞周期蛋白D1(cyclinD1)與Wnt/β-catenin信號通路在哮喘氣道重塑中的關聯(lián)性。
　　方法：
　　選取無特定病原體(specific pathogenfree，SPF)級健康雄性

2、Sprague-Dawley(SD)大鼠16只，年齡為8周，體重為180-200g，隨機分成哮喘氣道重塑組和正常對照組兩組，每組大鼠各8只。哮喘氣道重塑組大鼠用雞卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)作為致敏物，通過致敏2周、激發(fā)8周建立大鼠哮喘氣道重塑模型，正常對照組大鼠相應采用生理鹽水進行處理。末次激發(fā)后處死大鼠，觀察肺組織大體外觀，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosin staining，HE)染色觀察兩組

3、大鼠肺組織的病理結構，采用彩色醫(yī)學圖像分析技術測定兩組大鼠支氣管管壁厚度(Wat)和支氣管平滑肌厚度(wam)，免疫組織化學法檢測肺組織中Wnt5a、β-catenin、Dvl1、c-Myc和cyclinD1蛋白的分布和表達情況，Western blot法測定肺組織勻漿中Wnt5a、β-catenin、Dvl1、c-Myc和cyclinD1蛋白的表達，采用實時熒光定量PCR法測定Wnt5a、β-catenin、Dvl1、c-Myc和cy

4、clinD1 mRNA的表達。
　　應用SPSS19.0軟件進行數(shù)據統(tǒng)計分析，計量數(shù)據資料以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，兩組樣本之間的均數(shù)比較采用t檢驗，方差齊性檢驗采用Levene檢驗，兩變量之間相關性分析采用直線相關分析法，P＜0.05表示差異有顯著性。
　　結果：
　　1.光鏡下顯示兩組大鼠肺組織病理學改變
　　正常對照組大鼠肺組織HE染色顯示正常小氣道和肺泡結構，肺組織結構完整，黏膜上皮完整，支氣管管

5、腔規(guī)則，支氣管、血管周圍未見炎性細胞的浸潤。哮喘氣道重塑組大鼠肺組織HE染色顯示氣道壁明顯增厚，基底膜不規(guī)則增厚，黏膜褶皺增多，出現(xiàn)上皮杯狀細胞增生和上皮細胞脫落，可見黏液腺增生、黏液栓形成和黏膜下水腫，管腔內可見滲出物和炎性細胞增多，支氣管黏膜下、支氣管和血管周圍可見EOS、中性粒細胞和淋巴細胞等炎癥細胞的廣泛浸潤。
　　2.圖像分析技術測定兩組大鼠支氣管管壁厚度(Wat)和平滑肌厚度(Wam)
　　哮喘氣道重塑組Wat數(shù)

6、值(62.28±5.10μm2/μm)較正常對照組(27.00±4.88μm2/μm)升高，差異顯著(P＜0.01)。哮喘氣道重塑組Wam數(shù)值(29.47±4.94μm2/μm)與正常對照組(12.60±1.14μm2/μm)比較，差異亦非常顯著(P＜0.01)。
　　3.免疫組織化學方法檢測Wnt5a、β-catenin、Dvl1、c-Myc和cyclinD1的蛋白表達
　　哮喘氣道重塑組大鼠肺組織Wnt5a蛋白的表達(0

7、.30±0.04)較正常對照組(0.18±0.03)增加，差異有顯著性(P＜0.01)。β-catenin蛋白在哮喘氣道重塑組(0.33±0.07)中表達與正常對照組(0.19±0.03)比較，差異有顯著性(P＜0.01)。正常對照組Dvl1蛋白呈少量表達(0.15±0.05)，哮喘氣道重塑組可見大量Dvl1蛋白的表達(0.50±0.06)，差異有顯著性(P＜0.01)。哮喘氣道重塑組c-Myc蛋白(0.41±0.13)的表達與正常對照

8、組(0.20±0.04)相比表達增加，差異有顯著性(P＜0.01)。cyclinD1蛋白在哮喘氣道重塑組為(0.31±0.04)的表達與正常對照組(0.15±0.03)相比亦存在顯著性差異(P＜0.01)。
　　4.Western blot法檢測Wnt5a、β-catenin、Dvl1、c-Myc和cyclinD1蛋白表達
　　哮喘氣道重塑組和正常對照組Wnt5a蛋白的相對灰度值分別為(0.47±0.01)和(0.09±0.

9、02)，差異有顯著性(P＜0.01)。哮喘氣道重塑組(7.22±2.08)較正常對照組(2.06±1.01)β-catenin蛋白的表達增加，差異有顯著性(P＜0.01)。哮喘氣道重塑組和正常對照組Dvl1蛋白的相對灰度值分別為(0.67±0.06)和(0.20±0.43)，差異有顯著性(P＜0.01)。哮喘氣道重塑組肺組織c-Myc蛋白(0.21±0.05)的表達與正常對照組(0.12±0.05)相比表達明顯增多(P＜0.01)。兩組

10、大鼠cyclinD1蛋白相對灰度值比較，哮喘氣道重塑組(0.75±0.19)的表達與正常對照組(0.29±0.09)亦存在顯著性差異(P＜0.01)。
　　5.熒光定量PCR法檢測各組大鼠肺組織Wnt5a、β-catenin、Dvl1、c-Myc、cyclinD1的mRNA表達結果
　　哮喘氣道重塑組Wnt5a、β-catenin、Dvl1、c-Myc、cyclinD1的mRNA表達結果均較正常對照組增加，差異有顯著性(P＜

11、0.01)。
　　6.相關性分析
　?、賅at、Wam均與大鼠肺組織Wnt5a蛋白的表達(MOD值)呈顯著正相關(分別為r=0.877，r=0.906，均P＜0.01，n=16)，Wat、Wam均與大鼠肺組織β-catenin蛋白的表達(MOD值)呈顯著正相關(分別為r=0.821，r=0.854，均P＜0.01，n=16)，Wat、Wam均與大鼠肺組織Dvl1蛋白的表達(MOD值)呈顯著正相關(分別為r=0.892, r=

12、0.904，均P＜0.01, n=16)。
　?、诖笫蠓谓M織中Wnt5a蛋白的表達(MOD值)與β-catenin蛋白、Dvl1蛋白的表達均呈顯著正相關(分別為r=0.822，r=0.920，均P＜0.01，n=16)。
　?、踂at、Wam均與大鼠肺組織c-Myc蛋白的表達(MOD值)呈顯著正相關(分別為r=0.787，r=0.853，均P＜0.01，n=16)，Wat、Wam均與大鼠肺組織cyclinD1蛋白的表達(MO

13、D值)呈顯著正相關(分別為r=0.917，r=0.926，均P＜0.01，n=16)。
　?、艽笫蠓谓M織中Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的表達(MOD值)與c-Myc蛋白的表達呈顯著正相關(r=0.897，r=0.808，P＜0.01，n=16)，Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的表達與cyclinD1蛋白的表達呈顯著正相關(r=0.867，r=0.807，P＜0.01，n=16)。
　　結論：
　　1.