Wnt-β-catenin信號通路調(diào)控原發(fā)性肝癌形成的機制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌（primer hepitia cancer，PHC）是世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，中國是原發(fā)性肝癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率和死亡率均位居世界首位。由于其發(fā)病較為隱匿、發(fā)病快、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，加之缺乏有效的治療手段，嚴重威脅著人類的健康。因此，闡明肝癌的發(fā)病機制將有助于其診斷和治療。
　　Wnt/β-catenin信號通路不僅在胚胎發(fā)育、細胞分化、組織修復(fù)中起重要調(diào)控作用，而且與腫瘤包括原發(fā)性肝癌的發(fā)生也密切相關(guān)，已經(jīng)

2、成為當今肝癌研究的熱點。Wnt/β-catenin信號可通過關(guān)鍵蛋白β-catenin入核介導與細胞增殖轉(zhuǎn)移、血管生成相關(guān)等靶基因表達，如c-myc、cyclin-D1、VEGF、MMPs。Wnt/β-catenin信號異常在許多肝臟疾病中均有報導，如慢性肝炎、肝纖維化，提示其可能參與肝癌形成過程中各個環(huán)節(jié)促進肝癌形成。因此，明確Wnt/β-catenin信號通路在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及詳細機制，可以為肝癌的診斷和治療提供新思路。

3、
　　β-Catenin在原發(fā)性肝細胞癌中的表達研究在國內(nèi)外均有報導，但是未就微量化學物質(zhì)二乙基亞硝胺（DEN）刺激肝炎產(chǎn)生，促進實驗動物肝脂肪化及肝纖維化進程，最終誘發(fā)原發(fā)性肝癌的病理進程做詳細探討，也未見微量化學物質(zhì)經(jīng)Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控原發(fā)性肝癌形成的動態(tài)變化研究報導。因此，本研究擬通過利用微量化學物質(zhì)DEN誘發(fā)小鼠原發(fā)性肝癌，研究Wnt/β-catenin信號在肝炎、肝脂肪化、肝纖維化、肝癌等病理階段過程

4、中的動態(tài)表達及其調(diào)控原發(fā)性肝癌形成的分子機制，為臨床藥物干預(yù)原發(fā)性肝癌提供科學依據(jù)。
　　目的：
　　探究β-catenin在原發(fā)性肝細胞癌小鼠模型中的動態(tài)表達以及其對肝癌形成的調(diào)控機制，為肝癌形成機制提供理論依據(jù)，為肝癌的診斷和治療提供新思路。方法：
　　1.采用DEN1.65 mg/10 g經(jīng)口給藥，建立小鼠原發(fā)性肝癌模型，利用H&E染色和Masson染色觀察肝臟組織病理學變化。
　　2.利用免疫組織染色法和

5、實時熒光定量 PCR法檢測并分析炎癥因子（COX-2，TNF-α）、脂肪化因子（PPAR-γ，AP-2）、纖維化因子（TGF-β1，Smad-2）等蛋白與核酸的表達變化規(guī)律。
　　3.利用免疫組織染色法和實時熒光定量PCR法檢測并分析β-catenin mRNA和其蛋白的表達水平，并探討它和COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、TGF-β1、Smad-2等因子的相關(guān)性。
　　4.體外培養(yǎng)HepG-2細胞，利用Wnt

6、3a（100 ng/ml）刺激HepG-2細胞，采用實時熒光定量PCR法和Western Blotting法分析β-catenin mRNA表達和其蛋白在細胞質(zhì)、細胞核中的表達分布差異。
　　5.利用實時熒光定量PCR法檢測并分析Wnt3a（100 ng/ml）刺激后，HepG-2細胞中COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、TGF-β1、Smad-2 mRNA表達變化。
　　結(jié)果：
　　1.整個實驗期間（共3

7、5周）模型組小鼠體重顯著低于正常對照組（P<0.05），但模型組小鼠體重仍然呈增長趨勢；化學物質(zhì)DEN刺激10周后，模型組小鼠肝臟指數(shù)逐漸升高，第25周后顯著高于正常對照組（P<0.05），而正常對照組肝臟指數(shù)無明顯變化。
　　2. HE染色結(jié)果顯示化學物質(zhì)DEN刺激后的第10周小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的肝細胞壞死、炎性細胞浸潤等現(xiàn)象；第15周肝臟出現(xiàn)脂肪變性；第20周肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，膠原纖維沉積；第25周肝細胞脂肪變性進一步加重，

8、出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)；第30周肝細胞核質(zhì)比增大、異形度增加、高倍鏡下可見有絲分裂相。Masson染色結(jié)果顯示，化學物質(zhì)DEN刺激后第10周、第15周，未見明顯的膠原蛋白沉積；而化學物質(zhì)DEN刺激后第20-25周，肝門脈域出現(xiàn)纖維組織增生；第30-35周增生的膠原束包繞分割肝小葉，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，假小葉形成。
　　3. RT-PCR結(jié)果顯示化學物質(zhì) DEN刺激后第10周時模型組肝臟 COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、T

9、GF-β1、Smad-2 mRNA表達顯著高于正常對照組（P<0.05），且均有逐漸升高趨勢，而正常對照組肝臟上述因子mRNA水平無明顯變化。比較上述因子 mRNA水平在腫瘤組織、鄰近癌旁組織和正常肝臟組織中表達差異，發(fā)現(xiàn)上述因子 mRNA水平在腫瘤組織中表達最高、其次為在鄰近癌旁組織，而在正常肝臟組織的相應(yīng)表達最低，各組比較均有顯著差異（P<0.05）。免疫染色結(jié)果表明相對于正常組肝臟組織，模型組肝臟組織中COX-2、PPAR-γ、A

10、P-2、TGF-β1、Smad-2等蛋白呈陽性表達，且隨著化學物質(zhì) DEN刺激后時間延長而逐漸增加。
　　4.免疫組織染色結(jié)果顯示，β-catenin蛋白在化學物質(zhì)DEN刺激后第10周主要在肝細胞細胞漿表達，有少量在核內(nèi)表達，并呈明顯的時間依賴關(guān)系；第30周、35周，β-catenin主要在肝細胞細胞核內(nèi)表達。RT-PCR結(jié)果顯示化學物質(zhì)DEN刺激后第10周時模型組肝臟β-catenin mRNA表達顯著高于正常對照組（P<0.0

11、5），且有逐漸升高趨勢，而正常對照組肝臟β-catenin mRNA水平無明顯變化。RT-PCR結(jié)果肝癌組織中β-catenin mRNA表達顯著高于癌旁組織（P<0.05）。免疫組織染色結(jié)果顯示，肝癌組織中β-catenin蛋白的細胞質(zhì)和細胞核陽性率顯著高于癌旁組織（P<0.05）。
　　5.將模型組分為兩組：β-catenin核陽性表達組（記做β-catenin N+）和β-catenin核陰性表達組（記做β-catenin

12、N-）。比較β-catenin的核表達差異與COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、TGF-β1、Smad-2 mRNA表達的相關(guān)性，顯示β-catenin N+組上述因子的mRNA表達水平均顯著高于β-catenin N-組（P<0.05）。
　　6.將所有成瘤樣本（15例）分為兩組：β-catenin核陽性表達組（記做β-catenin N+）和β-catenin核陰性表達組（記做β-catenin N-）。β-cat

13、enin N+組肝臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和有絲分裂相數(shù)均顯著高于β-catenin N-組（P<0.05）。
　　7.體外細胞實驗中，RT-PCR結(jié)果顯示，Wnt3a（100 ng/ml）刺激 HepG-2細胞不同時間6 h、18 h和24 h后，β-catenin mRNA呈時間依賴升高。Western blotting結(jié)果顯示，β-catenin總蛋白、細胞質(zhì)蛋白、核蛋白水平也呈時間依賴增加。
　　8. RT-PCR結(jié)果顯示，Wn

14、t3a成功激活 HepG-2細胞 Wnt/β-catenin信號，COX-2、TNF-α、PPAR-γ、AP-2、TGF-β1、Smad-2 mRNA表達均有不同程度升高。
　　結(jié)論：
　　Wnt/β-catenin信號通路可通過上調(diào)炎癥因子（COX-2，TNF-α）、脂肪化因子（PPAR-γ，AP-2）、纖維化因子（TGF-β1，Smad-2）來刺激炎癥產(chǎn)生，促進脂肪化和纖維化病理進程，最終誘發(fā)原發(fā)性肝癌形成。Wnt/β-