姜黃素調(diào)節(jié)Wnt-β-catenin信號(hào)通路影響軟骨細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、背景:骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以退行性關(guān)節(jié)軟骨病變及繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要病理表現(xiàn)的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，多年來(lái)一直困擾著中老年人的健康，有年輕化的趨勢(shì)。長(zhǎng)久以來(lái)，中醫(yī)藥在治療骨科疾病方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其防治骨關(guān)節(jié)炎近幾年成為研究的大熱點(diǎn)。姜黃是治療骨傷疾病復(fù)方中的一味常用中藥，對(duì)治療骨關(guān)節(jié)炎有良好的療效。在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，伴隨著軟骨細(xì)胞中諸多信號(hào)通路信號(hào)因子的激活和抑制，其中較為重要的通路便是Wnt/β-

2、catenin。在骨關(guān)節(jié)的生長(zhǎng)、保護(hù)、修復(fù)過(guò)程中，Wnt/β-catenin通路起著至關(guān)重要的作用。
　　目的:探索姜黃素調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的效應(yīng)機(jī)制，在分子生物水平上進(jìn)一步闡釋中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理，證實(shí)中藥提取物在醫(yī)學(xué)組織工程學(xué)及分子生物學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:1.清潔級(jí)4周齡新西蘭大白兔雌雄各1只，用于建立體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的取材，應(yīng)用形態(tài)學(xué)觀察、甲苯胺藍(lán)染色等方法進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)

3、學(xué)鑒定;2.用MTT法分析第1～5代軟骨細(xì)胞10天內(nèi)增殖情況，繪制增殖曲線;3.用CCK-8法檢測(cè)各濃度姜黃素給藥24h對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響;4.用Western blot法分析檢測(cè)5μmol·L-1、10μmol·L-1姜黃素分別加藥10μl于軟骨細(xì)胞作用12h、24h后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Wnt2、GSK-3β、β-catenin相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)各代軟骨細(xì)胞初培養(yǎng)的前2天

4、OD值未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)，均生長(zhǎng)較為緩慢，等到第3天增殖明顯加快，第4天達(dá)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，第5天后增殖開(kāi)始減慢，第7天后生長(zhǎng)速度趨見(jiàn)平穩(wěn)，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，第9天增殖率較前下降，生長(zhǎng)出現(xiàn)停滯。
　　(2)25、20、10、5μmol·L-1姜黃素組，藥物顏色干擾影響小，指標(biāo)相對(duì)客觀準(zhǔn)確，與DMSO空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。隨著姜黃素濃度的降低，OD值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)姜黃素濃度在10

5、μmol·L-1時(shí)，OD值達(dá)頂峰，之后隨著藥物濃度的降低，OD值也降低。排除160、80、40μmol·L-1三組高誤差，發(fā)現(xiàn)10μmol·L-1姜黃素組顯示的OD值最高。
　　(3)24h姜黃素組的Wnt2及β-catenin蛋白表達(dá)量明顯高于DMSO對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中10μmol·L-1劑量組相對(duì)于5μmol·L-1劑量組具有更高的蛋白表達(dá)量。相同濃度組之間，作用24h的Wnt2及β-cateni

6、n蛋白表達(dá)量明顯高于12h，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。12h姜黃素組的Wnt2及β-catenin蛋白表達(dá)量略高于DMSO對(duì)照組，但差異不明顯(P＞0.05)。GSK-3β結(jié)果則正好與上述兩種蛋白表達(dá)結(jié)果相反。
　　結(jié)論:
　　(1)軟骨細(xì)胞傳代穩(wěn)定性最高的為第3代。
　　(2)姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的效果，且濃度在10μmol·L-1促增效果相對(duì)最佳，同樣給藥10μmol·L-1作用24h比12h更