中藥肝復(fù)康對(duì)肝纖維化時(shí)RHO通路干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 肝纖維化是肝臟受損后機(jī)體可逆的傷口愈合反應(yīng)階段，以ECM(extracellularmatrix)沉積為特點(diǎn)。如果不及時(shí)治療，將會(huì)導(dǎo)致肝硬化的形成。所以抗肝纖維化治療具有非常重要意義，但是目前對(duì)肝纖維化的機(jī)制尚不明確。RHO信號(hào)通路主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮，遷移，增殖，形態(tài)以及基因的表達(dá)。這個(gè)信號(hào)通路與很多疾病密切相關(guān)，如血管痙攣，腎纖維化，神經(jīng)損傷，肺動(dòng)脈高壓等。所以RHO信號(hào)通路具有潛在的臨床治療價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)的目的是

2、為了研究肝復(fù)康對(duì)肝纖維化時(shí)RHO信號(hào)通路干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 方法:
　　 整體實(shí)驗(yàn):健康的SD大鼠隨機(jī)被分為正常組，肝纖維化模型組及三組藥物治療組。正常組予皮下注射生理鹽水（0.5ml/kg），其余各組予等體積橄欖油稀釋的10％CCl4皮下注射，每周兩次，共12周。三組康復(fù)康中藥處理組分別為:高劑量組(3125mg/kg/day)，，中劑量組(312.5mg/kg/day)及低劑量組(31.25mg/kg/day)。

3、在第九周開(kāi)始給大鼠予肝復(fù)康高、中、低劑量治療。正常組與模型組在12周末處死并迅速取出肝組織，中藥治療組于第20周處死并取出肝組織，立即儲(chǔ)存于-70℃冰箱中。HE染色法觀察肝組織病理結(jié)構(gòu)的變化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)組織中RHOA，ROCKI，F(xiàn)AK，vinculin的mRNA水平的表達(dá)，免疫組織化學(xué)和免疫蛋白印記法(wersternblot)檢測(cè)組織中ROCKI蛋白水平的表達(dá)。
　　 離體實(shí)驗(yàn):HSC-T6細(xì)胞

4、培養(yǎng)在加入了10％胎牛血清，100U/ml青霉素G及100U/ml鏈霉素的DEMN培養(yǎng)基中，并置于孵育箱中培養(yǎng)(37℃，5％CO2及95％O2)。每?jī)商鞊Q液一次。細(xì)胞傳代后，實(shí)驗(yàn)在呈指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為三組:正常對(duì)照組（DEMN培養(yǎng)液+10％正常大鼠血清+HSC細(xì)胞），模型組（DEMN培養(yǎng)液+終濃度200umol/L乙醛+10％正常大鼠血清+HSC細(xì)胞），肝復(fù)康治療組（DEMN培養(yǎng)液+終濃度200umol/L乙醛+10％肝

5、復(fù)康中劑量組大鼠血清+HSC細(xì)胞）。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)細(xì)胞中RHOA，ROCKI，F(xiàn)AK，vinculin的mRNA水平的表達(dá)，免疫蛋白印記法(wersternblot)檢測(cè)細(xì)胞中ROCKI在蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)肝復(fù)康對(duì)大鼠肝組織中RHO信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響:HE染色觀察到正常肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索呈放射狀排列，肝細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)脂肪空泡。模型組可見(jiàn)假小葉生成，正

6、常肝小葉被破壞，多數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。中藥治療組肝組織纖維化表現(xiàn)不同程度的改善，以中劑量組最為明顯。RT-PCR結(jié)果顯示，在肝組織中RHO通路相關(guān)因子RHOA，ROCKI，F(xiàn)AK，vinculin在模型組均有明顯表達(dá)，而在正常組表達(dá)極少，肝復(fù)康治療組均使以上因子不同程度的下調(diào)，而中劑量治療效果最為明顯。免疫組織化學(xué)和westernblot結(jié)果顯示，在正常組ROCKI蛋白表達(dá)很微弱，而在模型組ROCKI的表達(dá)明顯上調(diào)，中

7、藥治療組均不同程度的使ROCKI表達(dá)下調(diào)，以中劑量治療組最為明顯，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (2)肝復(fù)康對(duì)大鼠HSC-T6細(xì)胞株中RHO信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)影響:RT-PCR結(jié)果顯示，RHO通路相關(guān)因子RHOA，ROCKI，F(xiàn)AK，vinculin在乙醛組均有明顯表達(dá)，而在正常組表達(dá)極少，肝復(fù)康中劑量治療組均使以上因子不同程度的下調(diào)，westernblot結(jié)果顯示，在正常組ROCKI蛋白表達(dá)很微弱，而在乙醛組R