舒肝寧對酒精性肝纖維化作用的實驗研究.pdf

1、目的：研究舒肝寧對酒精性肝纖維化的作用以及其作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法:（1）取雄性Wistar大鼠50只，予“酒精—吡唑—玉米油”混合液灌胃（1次/天）復(fù)制酒精性肝纖維化大鼠模型；另取同批大鼠10只，予生理鹽水灌胃作對照組。16周后將存活的造模大鼠（n=40）隨機(jī)分成模型組、舒肝寧高、中、低劑量組及安絡(luò)化纖丸組，每組各8只。對照組、模型組腹腔注射生理鹽水5 mL·kg-1，舒肝寧高、中、低劑量組分別腹腔注射舒肝

2、寧注射液4.8 mL·kg-1、2.4 mL·kg-1、1.2 mL·kg-1。安絡(luò)化纖丸組灌胃安絡(luò)化纖丸0.75 g·kg-1，各組動物每天給藥1次，連續(xù)治療8周。治療期間，造模動物繼續(xù)造模給藥。末次治療給藥后24 h，各組大鼠心臟取血，分離血清，用微板法檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平；用化學(xué)發(fā)光法檢測血清中肝纖維化四項指標(biāo)：血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PⅢNP）和Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）

3、。取血后處死大鼠，取肝組織，稱重，計算肝指數(shù)；取一小塊肝組織制備成肝組織勻漿，取上清檢測丙二醛（MDA)和超氧化物歧化酶（SOD)水平，剩余肝組織固定于10%中性福爾馬林中，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、行蘇木精-伊紅（HE)染色和Masson染色，鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變及肝纖維化情況。（2）建立大鼠肝星狀細(xì)胞-T6(HSC-T6)細(xì)胞活化的體外模型。采用MTT法觀察舒肝寧對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響，并篩選出合適的藥物濃度和作用時間；選擇舒

4、肝寧作用濃度為2.5%、1.25%、0.625%作為高、中、低劑量組，與HSC-T6細(xì)胞孵育24 h,并設(shè)正常對照組（含等體積的培養(yǎng)基），流式細(xì)胞儀（FCM)檢測不同藥物濃度對HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響；qPCR檢測不同藥物濃度對HSC-T6細(xì)胞Ⅰ和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：（1）大鼠一般情況：對照組大鼠精神狀態(tài)較好，活動自如，被毛干凈有光澤，飲水進(jìn)食正常，大小便無異常。造模組大鼠灌胃酒精混合液后初表現(xiàn)為興奮，后進(jìn)入

5、嗜睡狀態(tài)，造模3周后活動逐漸減少，并出現(xiàn)毛色暗淡、發(fā)黃、脫毛、豎毛等現(xiàn)象，飲水進(jìn)食減少，稀便。給予不同劑量的舒肝寧及安絡(luò)化纖丸治療后，大鼠精神狀態(tài)、活動情況、被毛、飲水進(jìn)食量以及大小便情況均明顯改善。與對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平明顯升高（P<0.05orP<0.01），HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C含量顯著上升（P<0.05orP<0.01），大鼠體重明顯下降（P<0.05），肝指數(shù)明顯升高（P<0.01），肝組織MDA

6、含量顯著上升（P<0.01），SOD含量明顯下降（P<0.01）；與模型組比較，舒肝寧高、中、低劑量組及安絡(luò)化纖丸組大鼠血清 ALT、AST水平明顯降低（P<0.05orP<0.01），HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C含量明顯下降（P<0.05orP<0.01），大鼠體重明顯升高（P<0.05），肝指數(shù)明顯下降（P<0.01），肝組織MDA含量顯著下降（P<0.05orP<0.01），SOD含量明顯上升（P<0.05orP<0.01）；肝組

7、織病理學(xué)檢測顯示：肉眼觀察見對照組大鼠肝臟大小適中，在自然光照下呈深紅色，表面光滑柔軟，邊緣銳圓。模型組大鼠肝臟明顯腫大，在自然光照下呈暗紅色或黃褐色，表面粗糙可見細(xì)小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較脆，邊緣發(fā)鈍。給藥組大鼠肝臟稍腫大，在自然光照下呈暗紅色，表面稍粗糙，質(zhì)地中等。HE染色可見，對照組見肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；模型組肝組織脂肪變性，大量肝細(xì)胞呈現(xiàn)空泡化，并有點、灶狀壞死伴炎細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)周圍有大量纖維組織沉積，部分肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞；

8、各給藥組肝組織脂肪變性、肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤及匯管區(qū)沉積的纖維組織均較模型組有不同程度的減少。Masson可見，肝細(xì)胞被染成紅色，膠原纖維被染成綠色，對照組匯管區(qū)有少許膠原纖維存在，模型組有大量膠原纖維呈綠色沉積在匯管區(qū)，破壞了部分肝小葉結(jié)構(gòu)。各給藥組綠色膠原纖維分布的范圍明顯減少，尤以舒肝寧中高劑量組纖維化改善更明顯。（2）舒肝寧對 HSC-T6細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，而且隨著藥物濃度的增加和刺激時間的延長，抑制作用更加明顯，

9、表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系及時效關(guān)系。FCM檢測結(jié)果顯示，舒肝寧低、中、高劑量組的早期凋亡率及中晚期凋亡率與死亡率均升高，中、高劑量組與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)差意義（P<0.05）；qPCR結(jié)果顯示舒肝寧藥物組能夠顯著抑制HSC-T6細(xì)胞Ⅰ和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)，與對照組比較，差異極具顯著性（P<0.01）。
　　結(jié)論：舒肝寧有抗酒精性肝纖維化的作用，其作用機(jī)制可能與保護(hù)肝細(xì)胞、減少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的分泌、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制H