姜黃素抗肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：采用四氯化碳腹腔內(nèi)注射制備小鼠肝纖維化模型，應(yīng)用姜黃素灌胃進(jìn)行干預(yù)治療，以免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法研究姜黃素對(duì)小鼠肝纖維化及肝組織中caspase-3蛋白和基因表達(dá)情況的影響，探討姜黃素對(duì)肝纖維化的阻斷作用；以不同濃度姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，探討姜黃素對(duì)肝星狀細(xì)胞的抑制，促使其凋亡，阻止肝纖維化的進(jìn)展，以進(jìn)一步揭示中醫(yī)藥在防治肝纖維化中的作用，為有效防治肝纖維化提供新的思路。
　　

2、 方法：選用8周齡健康雌性C57BL6/J小鼠40只，體重18～22g，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按隨機(jī)數(shù)字表法將40只小鼠隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組）、姜黃素預(yù)防組、姜黃素治療組和肝纖維化模型組。除正常對(duì)照組外，其余各組按5ul/g體重給予10％CCl4橄欖油溶液（即CCl4與橄欖油以1：9混合）腹腔注射，每周2次，共8周。姜黃索預(yù)防組和姜黃素治療組分別從第1、7周起按50 mg/kg體重給予姜黃素灌胃處理，每周3次。8周后在深度麻醉下處

3、死各組動(dòng)物，留取血清及肝組織標(biāo)本。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），采用日本Olympus AU2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；透明質(zhì)酸（HA）采用智能放免γ測(cè)量?jī)x自動(dòng)檢測(cè)計(jì)算結(jié)果；肝組織病理學(xué)變化采用蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson膠原染色觀察；肝組織α-SMA、caspase-3表達(dá)采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)；肝組織中caspase-3 mRNA的表達(dá)狀態(tài)采用RT-PCR法檢測(cè)分析；體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞用用不同濃度姜黃素分別處理

4、HSC-T6細(xì)胞24h后，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況。
　　 結(jié)果：⑴正常組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)整齊有光澤，活動(dòng)自由，食欲好，每周體重增長(zhǎng)正常。模型組大鼠隨著四氯化碳注射時(shí)間的延長(zhǎng)，變得易激惹，個(gè)別具有攻擊性，毛發(fā)失去光澤，紊亂，精神萎靡，食欲下降，體重增長(zhǎng)慢或不增。而姜黃素治療組隨著給藥天數(shù)的增加，造模時(shí)的癥狀逐漸得到改善。8周末，與正常組相比，預(yù)防組、對(duì)照組、模型組體小鼠體重明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

5、P值均<0.05）。與模型組比較，預(yù)防組和治療組小鼠體重有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均<0.05）。預(yù)防組和治療組小鼠體重相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。⑵實(shí)驗(yàn)小鼠血清ALT水平依次為：模型組>姜黃素預(yù)防組>姜黃素治療組>正常組（168.62±13.75 U/L、104.86±11.68 U/L、82.98±9.57U/L、47.91±8.08 U/L，P<0.05），各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HA水平依次為：模型組>治療組>預(yù)

6、防組>正常組（1609.95±125.91ng/ml、1290.26±127.59ng/m、953.39±98.48ng/ml、759.10±77.31ng/ml，P<0.05），各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑶正常組小鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉間未見(jiàn)纖維組織增生，無(wú)假小葉形成。模型組小鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)肝細(xì)胞水腫和脂肪變性，匯管區(qū)有大量纖維膠原增生，形成纖維分隔，有

7、假小葉形成。預(yù)防組僅見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)有少量纖維組織增生，無(wú)假小葉形成。治療組炎癥、纖維化程度較預(yù)防組重但明顯輕于模型組。⑷正常組僅血管壁可見(jiàn)少量α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，膽管壁不表達(dá)。模型組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯增多，主要分布于、門(mén)靜脈、匯管區(qū)血管壁、纖維間隔，少量表達(dá)于鄰近的肝實(shí)質(zhì)竇周間隙、偶見(jiàn)于中央靜脈壁，呈長(zhǎng)橢圓形或梭行。與正常組相比，預(yù)防組、治療組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)有所增加，但明顯少于模型組，各組水平依次為：模型組>治療組

8、>預(yù)防組>正常組（8.21±1.48、6.25±1.69、4.78±1.32、1.51±0.95，P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑸caspase-3免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿內(nèi)表達(dá)棕黃色顆粒。正常組小鼠僅中央靜脈、肝竇內(nèi)有少量陽(yáng)性分布。模型組小鼠肝組織中可見(jiàn)明顯表達(dá)，主要表達(dá)在肝細(xì)胞漿、中央靜脈、肝竇內(nèi)及纖維間隔。與正常組相比，預(yù)防組、治療組的肝組織caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)有所增加，但明顯少于模型組，各組水平依次為：模型組>

9、治療組>預(yù)防組>正常組（9.88±1.32、7.91±1.28、2.62±0.89、0.62±0.17，P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑹與正常組相比，模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織中caspase-3 mRNA表達(dá)明顯上升，預(yù)防組、治療組表達(dá)多于正常組而少于模型組，水平依次為：模型組>治療組>預(yù)防組>正常組（0.441±0.013、0.374±0.010、0.310±0.010、0.203±0.006，P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑺姜

10、黃素作用于HSC-T6細(xì)胞后，可誘導(dǎo)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)變化，如細(xì)胞胞體縮小、胞質(zhì)濃縮、胞核向外呈銳角突起、染色質(zhì)高度濃縮、核仁邊集于核膜下或呈新月形，有的細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂以及凋亡小體等典型細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征。流式細(xì)胞分析結(jié)果也顯示，curcumin能使HSC-T6細(xì)胞發(fā)生凋亡和生長(zhǎng)周期阻滯，處理24h后，凋亡率明顯增加，且呈濃度依賴(lài)性；G2/M期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

11、>　　 結(jié)論：①小鼠經(jīng)四氯化碳腹腔注射8周可誘導(dǎo)具有典型肝纖維化特征的動(dòng)物模型，此模型符合人類(lèi)肝纖維化發(fā)病的病理學(xué)特點(diǎn)。②姜黃素可改善肝功能及肝組織纖維、炎癥壞死程度，具有預(yù)防和治療肝纖維化的作用。③姜黃素可抑制肝組織caspase-3 mRNA及蛋白的表達(dá)，減輕肝纖維化和肝組織炎癥，阻止肝纖維化的進(jìn)展，提示其在治療肝纖維化中存在很大的前景。④姜黃素能抑制體外培養(yǎng)的大鼠HSC-T6生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，其作用