基于Wnt-β-catenin通路探討清熱祛活血法抗肝纖維化機(jī)制.pdf

1、前言:肝纖維化是各種致病因子導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥、壞死，肝臟中膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解與沉積失衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常增生的可逆性傷口愈合反應(yīng)。在肝纖維化發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞激活后，分泌并促進(jìn)過(guò)度的Ⅰ型膠原蛋白及其他細(xì)胞外基質(zhì)沉積。新興研究的Wnt/β-catenin通路，與肝星狀細(xì)胞的激活、肝纖維化的發(fā)生發(fā)展也存在著一定的關(guān)系。肝纖維化的中醫(yī)病因病機(jī)復(fù)雜多變，其病機(jī)關(guān)鍵是濕熱

2、留戀，以致濕濁瘀熱互結(jié)，肝絡(luò)受損。本課題組既往的研究發(fā)現(xiàn)，基于清熱祛濕活血立法的加味茵芍散治療慢性肝炎和肝纖維化有一定療效，可緩解、逆轉(zhuǎn)肝纖維化病人肝纖維化進(jìn)展。因此制定清熱祛濕活血的治法并探討該治法抗肝纖維化機(jī)制可更好的為臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察大鼠ALT、AST、透明質(zhì)酸酶(HA)、Ⅳ膠原蛋白、Ⅲ型前膠原肽(PⅢNP)、層粘連蛋白(LN)血清水平，肝組織病理變化情況，TGF-β、β-cateninm

3、RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討清熱祛濕活血法抗肝纖維化的分子機(jī)制，為中醫(yī)藥防治肝纖維化尋找新的作用靶點(diǎn)和途徑。
　　方法:成年雄性Wistar大鼠60只隨機(jī)分組為給藥組、造模組和正常組。造模給予四氯化碳皮下注射，輔以高脂飲食和30％酒精為唯一飲用水，共16周。第5周起給予中藥和秋水仙堿每天灌胃干預(yù)，12周后處死。檢測(cè)血清ALT、AST、HA、Ⅳ膠原蛋白、PⅢNP、LN，HE染色和Masson染色觀察各組大鼠肝組織病理變化情況

4、。免疫組化檢測(cè)各組大鼠肝組織TGF-β和β-catenin表達(dá)情況，RT-PCR和Western Blot檢測(cè)TGF-β和β-cateninmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果:經(jīng)過(guò)造模及灌胃干預(yù)后，中藥組的大鼠肝功能情況及反映肝纖維化的四項(xiàng)血清指標(biāo)較造模組明顯好轉(zhuǎn);中藥高劑量組與秋水仙堿組相比，血清ALT、AST、Ⅳ型膠原蛋白、HA、PⅢNP值均明顯下降。HE染色及Masson染色見(jiàn)正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞

5、繞中央靜脈成放射狀，細(xì)胞周圍有少量膠原纖維排列整齊;模型組大鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、細(xì)胞排列紊亂、伴隨大量細(xì)胞空泡樣變性，大量膠原包繞細(xì)胞，可見(jiàn)部分細(xì)胞內(nèi)亦有綠色物質(zhì);中藥高劑量組、中藥中劑量組肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞程度較輕，部分細(xì)胞脂滴形成，膠原纖維形成，程度較造模組、秋水仙堿組輕。免疫組化結(jié)果見(jiàn)造模組TGF-β、β-catenin陽(yáng)性表達(dá)高于給藥組，秋水仙堿組TGF-β、β-catenin陽(yáng)性表達(dá)高于中藥高劑量組。RT-PCR和Wes