乙肝大鼠模型建立及相關(guān)肝纖維化研究.pdf

1、目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球范圍影響人類健康的重要問題，目前全球慢性乙肝感染者約有4億人。HBV慢性化進程往往伴隨著肝纖維化的發(fā)生，肝纖維化是慢性肝炎向肝硬化、肝癌發(fā)展的必經(jīng)階段。如若活動性肝纖維化得不到有效控制，最終約10％-30％可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。我國屬于HBV高流行區(qū)，乙肝肝纖維化是我國常見肝纖維化原因之一。目前認為其機制歸因于肝細胞的損傷與免疫細胞及細胞因子在肝組織局部浸潤。

2、持續(xù)HBV體內(nèi)復(fù)制可加速肝纖維的病理損傷，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(ECM)在肝內(nèi)過度沉積。HBV具有非常嚴格的宿主特異性，自然狀態(tài)下僅感染人類及靈長類動物，由于缺乏合適的HBV實驗動物模型，對慢性乙肝感染及該過程中發(fā)生的肝細胞損傷機制仍缺乏深入了解。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型是目前最常用的動物模型，這種轉(zhuǎn)基因小鼠的HBV基因整合在宿主染色體中，其自身處于免疫耐受狀態(tài)，可實現(xiàn)持續(xù)HBV體內(nèi)的復(fù)制，但因其不形成HBV前基因組RNA復(fù)制的原始模板cccDN

3、A，同時免疫耐受也不利于觀察到小鼠肝損傷后修復(fù)反應(yīng)及肝纖維化形成。而目前實驗用肝纖維化動物模型多采用施以不同劑量肝毒劑化學(xué)誘導(dǎo)法建模，如四氯化碳、二甲基亞硝胺、乙醇等，還包括免疫誘導(dǎo)法、膽管阻塞法及復(fù)合方法等，這些肝纖維化動物模型具有造模簡單，成模率高，死亡率低，重復(fù)性佳等特點，但與我國極常見的乙肝肝纖維化發(fā)病機制相差甚遠。如何建立與人HBV自然狀態(tài)感染過程類似的HBV動物模型，是研究其發(fā)病機制及治療應(yīng)用的基礎(chǔ)，也是研究如何阻斷乙肝肝纖

4、維化進程的關(guān)鍵。
　　重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)是臨床治療基因病常用病毒載體之一，根據(jù)AAV8亞型的高嗜肝性特點，本研究應(yīng)用攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組8型腺相關(guān)病毒載體(rAAV8-1.3HBV)經(jīng)腹腔注射法導(dǎo)入SD大鼠體內(nèi)，擬建立一種新型的模擬人類HBV感染及相關(guān)肝纖維化進程的實驗動物模型，旨在為國內(nèi)乙肝肝纖維化研究提供新視角。
　　方法:采用rA

5、AV8-1.3HBV經(jīng)腹腔注射新生SD大鼠，固定時間點（2周、4周、8周、12周）檢測大鼠血清及肝臟中乙肝抗原(HBsAg、HBeAg)表達及HBV DNA拷貝數(shù)，第12周處死并采集大鼠肝臟，制作病理切片行HE和Masson染色評價肝組織炎癥活動度分級和肝纖維化分期，免疫組化檢測乙肝核心抗原(HBcAg)陽性肝細胞的表達情況，以及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、平滑肌肌動蛋白(a-SMA)等肝纖維相關(guān)因子的表達。
　　結(jié)果:實驗

6、組大鼠（0日齡，6雄7雌）腹腔注射1×1011vg的rAAV8-1.3HBV，對照組注射等體積PBS溶液。2周后采用ELISA法檢測血清中HBsAg、HBeAg，實驗組雄性3820±828IU/mL，雌性3369±1581IU/mL，HBeAg分別為133±46 NCU/mL和77±71NCU/mL，乙肝抗原均為強陽性，感染率100％;4周、8周時血清HBsAg、HBeAg仍為陽性，但HBeAg下降趨勢較明顯;12周時實驗組HBsAg顯

7、示呈弱陽性，HBeAg基本為陰性(n=11，84.6％)，對照組乙肝抗原檢測全陰。熒光定量PCR法檢測大鼠血清及肝臟HBV DNA拷貝數(shù)，2周時血清HBV DNA波動于2.95×106至8.27×104copy/mL，個體間存在差異，總體雄性略高于雌性，隨時間變化拷貝數(shù)緩慢下降，但12周時仍維持較高拷貝數(shù);第12周檢測肝臟HBV DNA拷貝數(shù)明顯高于同期血清含量(p＜0.001)。第12周處死大鼠取肝臟做病理切片。HE染色見實驗組普遍出

8、現(xiàn)肝細胞腫脹、點灶狀壞死及嗜酸性變，匯管區(qū)擴大及淋巴細胞浸潤炎性改變。Masson染色見匯管區(qū)周圍纖維化，有不同程度纖維間隔形成，無假小葉形成。肝臟免疫組化證實肝內(nèi)存在HBcAg陽性細胞，這直接證明了rAAV8-1.3HBV注射建模法可感染大鼠肝細胞并持續(xù)進行HBV肝內(nèi)復(fù)制。免疫組化同時觀察到TGF-β1細胞因子的陽性表達，提示該模型已啟動乙肝肝纖維化進程。
　　結(jié)論:經(jīng)檢索國內(nèi)外尚無此類大鼠模型的報道。本項目首次利用rAAV8-