大鼠肝纖維化組織差異MicroRNA的篩選及其與纖維化相關(guān)性分析.pdf

1、在肝組織存在纖維化甚至肝硬化的病理改變基礎(chǔ)上，各種致病因子的打擊更容易造成嚴(yán)重的肝功能衰竭。終末期肝功能衰竭，臨床治療效果差，給人民健康及醫(yī)療財(cái)政帶來了嚴(yán)峻的考驗(yàn)。眾多研究表明肝纖維化形成機(jī)制復(fù)雜，但具有可逆性。近年來研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA在調(diào)控肝纖維化形成過程中發(fā)揮著重要的作用，有研究表明促肝纖維化發(fā)展的MicroRNA，其抑制劑能有效的逆轉(zhuǎn)肝纖維化。因此有關(guān)肝纖維化的MicroRNA研究可能為臨床治療肝纖維化帶來新的突破。

2、　　第一部分:構(gòu)建大鼠免疫性肝纖維化模型
　　目的:明確是否成功構(gòu)建大鼠免疫性肝纖維化模型。
　　方法:將26只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組(A、B)，A組10只，B組16只。A組為正常對照組，生理鹽水腹腔注射（0.5ml/只，2次/周）連續(xù)12周;B組為肝纖維化模型組，其中隨機(jī)選取3只為B1組，腹腔注射豬血清0.5ml/只/次，2次/周，共4周;繼續(xù)隨機(jī)抽選3只為B2組，腹腔注射豬血清0.5ml/只/次，2次/周，共8

3、周;余下10只為B3組，腹腔注射豬血清0.5ml/只/次，2次/周，共12周。B1、B2組實(shí)驗(yàn)動物分別在第4周末及第8周末處死，留取肝組織進(jìn)行HE染色、Masson染色，余下全部實(shí)驗(yàn)動物在第12周末次給藥次日處死，留取肝組織進(jìn)行HE及Masson染色，依據(jù)肝纖維化病理分期方案對大鼠肝纖維化程度進(jìn)行評分，對膠原纖維面積實(shí)行半定量分析。
　　結(jié)果:1.HE及Masson染色圖示:肝纖維化模型B1組的肝組織形態(tài)學(xué)改變不明顯;B2組肝細(xì)胞

4、存在腫脹變性，肝索結(jié)構(gòu)排列較紊亂，結(jié)締組織有增生，纖細(xì)的纖維間隔形成，但是未見假小葉;B3組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索排列不規(guī)則，肝竇扭曲，結(jié)締組織明顯增生，纖維間隔形成;2.肝纖維化模型B3組肝纖維化程度及膠原纖維面積較正常A組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:通過連續(xù)12周向Wistar大鼠腹腔注射豬血清可成功構(gòu)建大鼠免疫性肝纖維化模型。
　　第二部分:分析大鼠肝纖維化組織與正常肝組織中MicroRNA

5、的表達(dá)差異
　　目的:探索大鼠肝纖維化組織與正常肝組織中MicroRNA的表達(dá)差異。
　　方法:在A組與B3組中分別選取3份肝組織標(biāo)本，用trizol保存送至深圳華大基因進(jìn)行RNA提取及MicroRNA高通量測序技術(shù)檢測，然后分析其表達(dá)譜差異，再運(yùn)用qPCR技術(shù)進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。
　　結(jié)果:與大鼠正常肝組織相比，在豬血清誘導(dǎo)的大鼠免疫性肝纖維化組織中總共有9種MicroRNA發(fā)生了變化，其中MicroRNA-1、Micro

6、RNA-30b-5p、 MicroRNA-144 MicroRNA-451、MicroRNA-674-3p表達(dá)下調(diào)，而MicroRNA-27a、 MicroRNA-138、MicroRNA-146b、 MicroRNA-342-5p則表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:在豬血清誘導(dǎo)的大鼠免疫性肝纖維化組織中MicroRNA的表達(dá)譜較正常大鼠肝組織發(fā)生了變化，這些具有顯著差異的MicroRNA可能與肝纖維化的發(fā)生相關(guān)。
　　第三部分:研究M

7、icroRNA-138與肝纖維化細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性
　　目的:驗(yàn)證MicroRNA-138與肝纖維化的發(fā)生存在相關(guān)。
　　方法:運(yùn)用qPCR技術(shù)檢測A組及B3組（各10只，共20只）全部大鼠肝組織中MicroRNA-138的水平，并同時(shí)檢測TGF-β、COL-1、TIMP-1、CTGF的表達(dá)。最后運(yùn)用spss軟件統(tǒng)計(jì)分析MicroRNA-138水平與TGF-β、COL-1、TIMP-1、CTGF表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)

8、果:1.qPCR技術(shù)檢測顯示MicroRNA-138、TGF-β、COL-1、TIMP-1、CTGF在大鼠肝纖維化組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);2.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MicroRNA-138與TGF-β、COL-1、TIMP-1及CTGF的相關(guān)系數(shù)分別為0.818、0.913、0.87和0.82，顯著性均為p=0.000＜0.01，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:MicroRNA-138與豬血清誘導(dǎo)大