肝纖維化進程相關(guān)microRNA表達譜的篩選.pdf

1、研究背景：
　　 肝纖維化是一種肝內(nèi)慢性損傷修復(fù)反應(yīng)，是在各種致病因子(如炎癥、損傷、藥物、遺傳因素等)作用下，肝內(nèi)纖維組織異常增生，細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)彌漫性大量產(chǎn)生和沉積，合成和降解失衡，繼發(fā)肝臟自我修復(fù)的動態(tài)可逆性病理過程。肝纖維化損害肝組織的結(jié)構(gòu)和功能，其進程若得不到阻抑或逆轉(zhuǎn)，將可逐漸發(fā)展為肝硬化甚至預(yù)后極差的肝功能衰竭等終末期肝臟疾病，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和預(yù)后。盡管國內(nèi)外

2、對肝纖維化發(fā)生發(fā)展分子機制及相應(yīng)的防治策略的研究極其重視、并取得了一系列讓人鼓舞的成就，但迄今尚無十分有效的減緩/逆轉(zhuǎn)肝纖維化的手段。
　　 肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells，HSC)是存在于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞之間的肝臟竇周的狄氏間隙中的維生素A儲存細(xì)胞，近幾十年的深入研究表明HSC的活化增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。HSC在自身及肝細(xì)胞、血小板及竇內(nèi)皮細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子共同作用下，活化轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w

3、維細(xì)胞(myofibroblast，MFs)發(fā)生表型及功能改變，通過旁分泌或自分泌機制，促使MFs增殖，合成大量的膠原和蛋白多糖等ECM，最終導(dǎo)致肝內(nèi)形成大量膠原纖維。既往肝纖維化分子水平的研究絕大多數(shù)集中于HSC活化增殖、ECM合成相關(guān)信號通路：如細(xì)胞周期，凋亡通路，炎性因子、促纖維化因子等細(xì)胞因子，然而目前為止，針對肝星狀細(xì)胞活化的治療方法對臨床肝纖維化的緩解/逆轉(zhuǎn)效果尚不明確。
　　 隨著表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控作用在肝纖維化發(fā)

4、生發(fā)展機制中的發(fā)現(xiàn)，miRNA這一非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)在肝纖維化進程中的作用正逐漸引起人們重視。microRNA(miRNA)是一類長度18-26nt的小分子非編碼RNA，其通過與靶基因3’-UTRs的序列特異性結(jié)合的方式調(diào)節(jié)靶基因的表達，進而影響多種生理和病理過程。miRNA的突變、異常表達和異常加工均會影響其正常功能，在轉(zhuǎn)錄后水平影響基因表達，通過細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)狀調(diào)控體系，對生物體的發(fā)育、分化、增殖

5、、凋亡、免疫調(diào)控等生理活動進行精確調(diào)節(jié)。近年研究表明，miRNA可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、脂代謝/脂肪酸代謝等一系列相關(guān)信號通路在許多肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用?；趯iRNA這一表觀遺傳學(xué)機制的逐步了解，為研究肝纖維化發(fā)生發(fā)展分子機制提供了新思路，因此尋找參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)鍵miRNA和相關(guān)信號通路顯得尤為重要。而有研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA可在體外HSC活化增殖進程中差異性表達，其中一些miRNA可參與H

6、SC活化增殖相關(guān)調(diào)控機制，如miR-15b/16可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)通路提升活化態(tài)HSC(aHSC)的凋亡率；miR-27a/27b可影響脂代謝，促進HSC活化增殖。提示miRNA可通過多種途徑調(diào)控HSC生物學(xué)行為從而影響肝纖維化進程。通過研究miRNA在體內(nèi)肝纖維化過程中的差異性表達，有助于更深入理解肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機制，亦有助于尋找新型肝纖維化分子調(diào)控靶點。
　　 本課題擬通過檢測二甲基亞硝胺(Dimethylnitro

7、samine，DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化模型中各級肝纖維化組織miRNA表達譜，篩選肝纖維化進程中差異性表達miRNA，并通過相關(guān)生物信息學(xué)分析闡明差異性表達的miRNA及其靶基因主要參與調(diào)控的信號通路；進一步篩選差異表達顯著miRNA的靶基因并進行驗證。實驗共分為三部分：第一部分，建立大鼠肝纖維化模型，對肝組織進行肝纖維化分級分組，為后期miRNA芯片表達譜研究做鋪墊；第二部分，研究miRNA在肝纖維化進程中的差異表達情況并對差異顯著的m

8、iRNA進行實時定量PCR驗證，初步分析相關(guān)信號通路構(gòu)建肝纖維化進程miRNA及其靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；第三部分，篩選差異表達顯著的miRNA的靶基因并檢測其是否參與肝纖維化進程。
　　 第一部分：大鼠肝纖維化模型建立
　　 目的：建立大鼠肝纖維化模型，觀察隨著造模周期延續(xù)，DMN對大鼠的一般情況及肝臟病理組織學(xué)改變，成功獲得各級大鼠肝纖維化組織，為后期miRNA芯片表達譜研究做材料準(zhǔn)備。
　　 方法：對SD大鼠行DM

9、N連續(xù)腹腔內(nèi)注射以建立SD大鼠肝纖維化模型，對照組大鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水。以7天為一周期定期觀察大鼠一般情況改變并處死部分大鼠取肝組織采用HE染色及Masson、VG特殊染色法行病理學(xué)分析，判斷大鼠肝纖維化程度。
　　 結(jié)果：(1)隨著造模周期延續(xù)，大鼠一般情況都發(fā)生相應(yīng)改變，模型組大鼠各時間段活動、排便、體毛密度和光澤度、體重均低于對照組；(2)造模早期大鼠肝臟較正常組稍大，后期肝臟體積則小于對照組，肝臟表面逐漸出現(xiàn)沙

10、礫結(jié)節(jié)感；(3)HE染色及Masson、VG特殊染色觀察：對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，未見變性和壞死區(qū)。模型組均可見變性甚至壞死和炎性滲出，大鼠肝臟中逐步出現(xiàn)門管區(qū)和小葉內(nèi)膠原纖維并最終形成纖維隔和假小葉(纖維化程度逐周加重)。
　　 結(jié)論：SD大鼠經(jīng)DMN連續(xù)腹腔注射可成功誘導(dǎo)肝纖維化，經(jīng)選取的各周肝組織可代表肝纖維化組織病理學(xué)分級特點，且與臨床肝纖維化分級相符。
　　 第二部分：肝

11、纖維化進程中差異表達miRNA篩選及生物信息學(xué)分析
　　 目的：研究miRNA在肝纖維化進程中的差異表達情況并進行驗證，初步分析相關(guān)信號通路構(gòu)建肝纖維化進程miRNA及其靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　 方法：(1)根據(jù)前期肝纖維化組織病理分級分組結(jié)果選取各級肝纖維化組織，利用miRNA芯片初步篩選出在各級肝纖維化組織中差異性表達的miRNA；(2)實時定量PCR檢測部分miRNA在不同級別肝纖維化組織中的表達(3)miRNA靶基

12、因功能顯著性分析和參與的代謝通路顯著性分析，(4)構(gòu)建靶miRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，得到肝纖維化進程miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起核心調(diào)控作用的miRNA和被miRNA調(diào)控的關(guān)鍵靶基因。
　　 結(jié)果：(1)miRNA芯片分析結(jié)果表明，隨著肝纖維化發(fā)展，肝組織中有23條miRNA差異性表達；(2)選取芯片中表達水平上升最顯著的miRNA進行實時定量PCR檢測，結(jié)果表明在肝纖維化的進程中miR-34family發(fā)生了顯著上調(diào)，此結(jié)果與芯片

13、結(jié)果一致，其中miR-34a/34c的上調(diào)水平與大鼠肝纖維化程度呈正相關(guān)；(3)靶基因GO分析及pathway分析結(jié)果表明：差異性表達的miRNA及其靶基因參與的基因功能和相關(guān)信號通路中，脂代謝/脂肪酸代謝的基因功能及相關(guān)通路的富集度最高；(4)miRNA-Gene-Network分析結(jié)果顯示長鏈?；o酶A合成酶家族成員1(ACSL1)位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心，受5個miRNA共同調(diào)控。
　　 結(jié)論：肝纖維化進程中存在miRNA差異性表

14、達，miR-34a/34c在纖維化肝臟中的上調(diào)水平與大鼠肝纖維化程度呈正相關(guān)，差異性表達miRNA的靶基因主要參與調(diào)控脂代謝/脂肪酸代謝相關(guān)通路，ACSL1受miR-34family等5個miRNA共同調(diào)控，可能是肝纖維化進程中重要調(diào)控分子。
　　 第三部分：ACSL1與miR-34famliy靶向關(guān)系檢測及其與肝纖維化分級相關(guān)性研究
　　 目的：篩選miR-34famliy候選靶基因，驗證miR-34famliy與AC

15、SL1靶向關(guān)系，研究ACSL1在各級肝纖維化組織中的mRNA和蛋白表達水平。
　　 方法：(1)預(yù)測miR-34famliy所調(diào)控的靶基因，根據(jù)組織特異性篩選可出現(xiàn)在肝臟的候選靶基因；(2)利用綠色熒光蛋白(EGFP)報告系統(tǒng)對miR-34famliy和預(yù)測的靶基因ACSL1的靶作用關(guān)系進行驗證；(3)利用實時定量PCR和Western-blot檢測ACSL1在肝纖維化進程中的mRNA及蛋白表達水平并分析。
　　 結(jié)果：

16、(1)ACSL1含有miR-34family的特異性結(jié)合位點；(2)經(jīng)EGFP報告系統(tǒng)檢測，ACSL1是miR-34a/34c的靶基因；(3)實時定量PCR和Western-blot技術(shù)檢測結(jié)果表明，隨著肝纖維化的發(fā)展，ACSL1mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平明顯降低，這提示ACSL1可能是肝纖維化進程重要的調(diào)控分子。
　　 結(jié)論：ACSL1表達水平與肝纖維化進程成負(fù)相關(guān)，miR-34a/34c及其靶基因ACSL1可能是肝纖維化