上調(diào)宿主microRNA-203對血吸蟲病肝纖維化的影響.pdf

1、血吸蟲病是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的寄生蟲病，廣泛流行于亞洲、非洲和拉丁美洲。寄生于人體的血吸蟲主要有6種，我國儀有日本血吸蟲流行。至09年底，我國仍有血吸蟲病流行縣（市、區(qū)）454個，全國血吸蟲病人約36萬例。血吸蟲病的病理基礎(chǔ)是宿主對血吸蟲成體和成熟蟲卵釋放的可溶性蟲卵抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)。血吸蟲感染早期，Th1反應(yīng)被適度激活，從而抵御在宿主體內(nèi)遷移的童蟲和在腸系膜靜脈中定植的成蟲。Th1反應(yīng)以TNF-α、IL-1、IL-6和IF

2、N-γ等細(xì)胞因子的水平升高為特征。隨著蟲卵在宿主組織中沉積，機(jī)體的免疫反應(yīng)快速轉(zhuǎn)變?yōu)門h2反應(yīng)，Th2反應(yīng)以IL-4、IL-13、IL-10等細(xì)胞因子的水平升高為特征。血吸蟲蟲卵引起的肝臟肉芽腫和纖維化病變是導(dǎo)致血吸蟲病患者死亡的主要原因。肝纖維化是肝肉芽腫的繼發(fā)性病變，過多的膠原蛋白沉積在肝組織將阻塞肝內(nèi)血流，引起腹水、脾臟腫大和食管胃底靜脈曲張等門脈高壓癥狀。在各種肝纖維化動物模型和導(dǎo)致人類肝纖維化的疾病中，激活的肝星狀細(xì)胞（Hep

3、atic Stellate Cells，HSC）被認(rèn)為是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞和肝組織中沉積的膠原蛋白的主要來源。靜止?fàn)顟B(tài)的HSC位于肝組織竇周間隙，是肝臟儲存維生素A的主要載體。在多種病理因素作用下，靜止型的HSC可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，遷移能力增強(qiáng)，分泌膠原蛋白增多，并能分泌多種促纖維化因子，引起肝纖維化。很多研究表明，HSC在血吸蟲病肝纖維化過程中也發(fā)揮了重要作用。因此，阻止HSC的激活或抑制HSC的活性可能能夠阻止血吸蟲病肝纖維

4、化的發(fā)生、發(fā)展。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)是一類高度保守的，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA分子。動物細(xì)胞中的miRNA主要可通過種子序列與靶基因的3'端非翻譯區(qū)的互補(bǔ)序列結(jié)合，抑制靶基因的翻譯過程，從而調(diào)控一系列生理病理過程，包括機(jī)體的生長發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生等過程。研究表明miRNA在多種因素如感染、乙醇或化學(xué)因素持續(xù)存在、代謝性疾病等引起的肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重

5、要的調(diào)控作用。miRNA在肝纖維化中的作用也有所報道。HSC是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，研究表明miRNA直接參與了HSC的激活、HSC活化后的凋亡、HSC膠原蛋白的合成等重要過程。這些研究不僅能幫助我們更好的理解肝纖維化的發(fā)生機(jī)制，更有助于尋找減緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新靶點。然而，miRNA是否在血吸蟲病肝纖維過程中發(fā)揮作用及其分子機(jī)制還有待于研究。
　　 本實驗室前期完成了血吸蟲感染后不同時間點小鼠肝臟miRNAs生物芯片分析工

6、作，動態(tài)觀察了miRNAs在血吸蟲病肝纖維化過程中的變化，結(jié)果顯示了miR-203在血吸蟲病肝纖維化過程中發(fā)生了表達(dá)下調(diào)，在血吸蟲感染后第42、49、56、和70天分別達(dá)到了0.49、0.33、0.41、0.48。本課題是在此基礎(chǔ)上，通過Real-time PCR的進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)miR-203在血吸蟲感染后第42、49、56、70和84天，分別是未感染組的0.47、0.23、0.31、0.18和0.40，經(jīng)初步生物信息學(xué)分析，確定了以

7、miR-203及其在小鼠血吸蟲病肝纖維化過程中的作用為研究內(nèi)容。
　　 本課題通過腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴，建立了血吸蟲病肝纖維化小鼠模型。以8型重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV8)為載體，構(gòu)建了特異性表達(dá)pri-miR-203的重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV8-pri-miR-203）。小鼠在感染血吸蟲后第10天尾靜脈注射rAAV8-pri-miR-203以上調(diào)小鼠

8、肝臟組織中miR-203的表達(dá)。通過與對照組比較，觀察特異性上調(diào)肝臟中miR-203對小鼠生存時間、肝臟蟲卵肉芽腫和纖維化的影響，進(jìn)而確定miR-203在血吸蟲病肝纖維化中的功能及機(jī)制。具體方法和結(jié)果如下:
　　 1.芯片結(jié)果的驗證:采用前期芯片檢測所用的小鼠肝臟樣本，即日本血吸蟲感染后第10、26、35、42、49、56、70和84天肝臟樣本以及未感染組肝臟樣本，重新抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用real-time PCR

9、方法檢測miR-203在各時間點的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，RT-PCR檢測的miR-203表達(dá)水平與芯片結(jié)果基本一致，在血吸蟲感染后第42、49、56、70和84天肝組織中，miR-203的表達(dá)明顯下調(diào)，分別是未感染組的0.47、0.23、0.31、0.18和0.40。
　　 2.上調(diào)miR-203表達(dá)對血吸蟲感染小鼠生存期的影響:小鼠感染致死量的日本血吸蟲尾蚴（30條），并在感染后的第10天通過尾靜脈注射6×109 rAAV8-p

10、ri-miR-203或等體積的PBS，在80天的觀察時間內(nèi)記錄各組小鼠的生存時間。結(jié)果顯示，通過注射rAAV8-pri-miR-203載體上調(diào)肝臟中miR-203表達(dá)的6只小鼠，4只在觀察期內(nèi)存活，另外2只小鼠分別在感染后59和74天死亡，而PBS組5只小鼠在感染后第54至65天期間內(nèi)相繼死亡，另外1在觀察期內(nèi)存活。兩組小鼠生存時間差異顯著(P＜0.05)。
　　 3.上調(diào)miR-203表達(dá)及其對血吸蟲病肝纖維化的影響:通過腹部

11、皮膚感染日本血吸蟲尾蚴（16條），建立了血吸蟲病肝纖維化小鼠模型，并在感染后的第10天通過尾靜脈注射5×109 rAAV8-pri-miR-203或等體積的PBS，通過與對照組比較，觀察特異性上調(diào)肝臟中miR-203后小鼠肝纖維化、肝細(xì)胞損傷、腸道粘膜屏障損傷、及機(jī)體Th1/Th2免疫反應(yīng)等相關(guān)指標(biāo)并選擇在感染后第42、56和70天檢測上述指標(biāo)。結(jié)果顯示，rAAV8-pri-miR-203組小鼠顯著提高肝臟中miR-203的表達(dá)，在感染

12、后第42和56天其表達(dá)水平是未感染組的7.69和2.18倍，并呈顯著性差異(P＜0.01)。但隨后miR-203表達(dá)呈下降趨勢，至感染后第70天rAAV8-pri-miR-203組小鼠miR-203的表達(dá)(0.67±0.10)與PBS組(0.53±0.13)相比無顯著性差異，P＞0.05。
　　 rAAV8介導(dǎo)的上調(diào)肝組織miR-203的表達(dá)對血吸蟲病肝纖維化的影響如下:(1)小鼠肝組織中羥脯氨酸含量顯著下降，與PBS組相比，在

13、感染后第42、56和70天的三個時間分別下降49.17％(P＜0.01)、35.36％(P＜0.01)、31.02％(P＜0.05);(2)rAAV8-pri-miR-203組小鼠較PBS組的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平在第42天顯著下降（37.71±21.55 vs173.62±33.67，P＜0.01），但在第56、70天未見明顯差異;(3)rAAV8-pri-miR-203組小鼠較PBS組的Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平在第42天（12.35±2.

14、97vs63.23±5.8，P＜0.01）、第56天顯著下降（5.95±2.16 vs20.05±8.91，P＜0.05），在第70天未見明顯差異。(4) rAAV8-pri-miR-203組小鼠較PBS組的血清ALT水平在第42、56天未見明顯差異，第70天顯著下降(74.91±5.38 vs100.75±16.70，P＜0.05)。其他檢測指標(biāo)各組間在3個時間點均未見明顯差異。
　　 4.miR-203在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)變

15、化:通過腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴，建立了血吸蟲病肝纖維化小鼠模型，并在感染后第10、26、35、42和56天，用原位消化和密度梯度離心法分離和純化肝臟中的HSC。每個時間點分離感染組和未感染組各3～5只小鼠的HSC，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用real-time PCR方法檢測各個時間點HSC miR-203的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，多次分離的HSC鏡檢觀察純度在95％～98％之間。正常小鼠肝星狀細(xì)胞的得率可達(dá)到2×106個/鼠左右

16、，血吸蟲感染小鼠肝星狀細(xì)胞的得率可達(dá)到3.6～4.8×106個/鼠左右。在血吸蟲感染后第42、56天，miR-203的表達(dá)維持在較低的水平，較未感染組分別下降6.25和3.45倍。鑒于HSC是纖維化時肝組織中沉積的膠原蛋白的主要來源，我們的結(jié)果提示miR-203可能參與了血吸蟲病肝纖維化過程中HSC激活的調(diào)控過程。本研究為進(jìn)一步探索miR-203抑制血吸病肝纖維化的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)處理
　　 實驗數(shù)

17、據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，兩組資料的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，多組資料的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和LSD-t檢驗;生存分析采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。
　　 小結(jié):
　　 本實驗室前期研究結(jié)果表明，感染日本血吸蟲小鼠肝臟的miR-203呈顯著下調(diào)。本課題通過構(gòu)建表達(dá)pri-miR-203的重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV

18、8-pri-miR-203），特異性上調(diào)感染小鼠肝臟miR-203的表達(dá)，并觀察干預(yù)后小鼠在血吸蟲病肝纖維化過程的變化，以探討miR-203在血吸蟲病肝纖維化中的功能。本課題采用腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴方法，建立了血吸蟲病肝纖維化小鼠模型。本課題研究結(jié)果顯示:(1)通過注射rAAV8-pri-miR-203病毒載體以上調(diào)肝組織中miR-203的表達(dá)，能顯著延長血吸蟲病小鼠的生存時間;(2)在血吸蟲感染后第10天尾靜脈注射5×109rA

19、AV8-pri-miR-203病毒載體，能有效提高肝臟中miR-203的表達(dá)水平，但這種上調(diào)表達(dá)水平隨著時間延長呈下降趨勢;(3)上調(diào)肝組織中miR-203使感染小鼠肝組織中羥脯氨酸含量及膠原蛋白表達(dá)水平呈明顯下降，這提示上調(diào)肝組織中miR-203可減輕感染小鼠的肝纖維化程度;(4)分離了日本血吸蟲感染小鼠及正常小鼠不同時間點的肝臟HSC，并檢測miR-203在這些細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，感染血吸蟲小鼠肝臟HSC的miR-203表達(dá)