PDDV誘生內(nèi)源性IFN-γ對(duì)小鼠血吸蟲病肝纖維化下調(diào)作用的研究.pdf

1、血吸蟲病是一種世界性的主要公共衛(wèi)生疾病，流行于全球74個(gè)國家和地區(qū)，主要分布于亞洲、非洲和拉丁美洲。我國歷經(jīng)半個(gè)多世紀(jì)的積極防治取得了巨大的成績，但是近年來，我國血吸蟲病有卷土重來之勢(shì)。目前全國共有血吸蟲病人67萬多人，主要是慢性和晚期血吸蟲病人(慢血和晚血)。慢血病人多發(fā)生肝纖維化繼而發(fā)展為晚血的肝硬化，治愈非常棘手。 血吸蟲病是一種免疫性疾病。血吸蟲不同蟲期釋放的抗原均能誘發(fā)宿主的免疫應(yīng)答，尤以蟲卵引起的肝腸蟲卵肉芽腫最為嚴(yán)

2、重，并進(jìn)而發(fā)生纖維化、甚至硬化，是慢血和晚血病人的主要病理表現(xiàn)。由此導(dǎo)致的肝脾腫大、門脈高壓和其他并發(fā)癥是晚血病人死亡的主要原因。肝纖維化的治療涉及祛除病因、抗氧化抗炎、調(diào)節(jié)肝臟膠原代謝、改善微循環(huán)及代謝障礙、減少并發(fā)癥(如門脈高壓等)等諸多環(huán)節(jié)，現(xiàn)今尚缺乏彳艮有效的抗纖維化藥物及方法。因此，探索阻遏肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的新途徑、新方法，不僅對(duì)血吸蟲病肝纖維化，而且對(duì)其他慢性肝病引起的肝纖維化的治療都極具價(jià)值。 本研究借鑒PDDV(

3、peptide-DNA dual vaccine)技術(shù)，將Th1型表位肽P4、P6、P18、P22分別與含相應(yīng)編碼DNA和佐劑CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotide)1826的重組質(zhì)粒結(jié)合而制備混合多價(jià)疫苗PDDV，以期用混合PDDV免疫小鼠，上調(diào)其Th1型應(yīng)答，誘導(dǎo)內(nèi)源性IFN-γ產(chǎn)生，從而最終達(dá)到下調(diào)血吸蟲病肝纖維化的目的。 第一部分：進(jìn)一步鑒定日本血吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶和副肌球蛋白的Th1型表位，為

4、構(gòu)建復(fù)合多價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)。 磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)是WHO/TDR提出的針對(duì)曼氏血吸蟲(Sch&tosoma mansoni，Sm)的6個(gè)最具潛力的疫苗候選分子之一。Reynolds等發(fā)現(xiàn)重組的TPI(rTPI)在較強(qiáng)的Th2微環(huán)境下仍可誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子，并從SmTPI序列中進(jìn)一步篩選出了C57BL/6J小鼠特異的T細(xì)胞表位SmTPI-P18，以及CBA小鼠而非C57BL/6J小鼠特異性的T細(xì)胞表位SmTPI-P9。日

5、本血吸蟲中國大陸株的TPI(SjTPI)與SmTPI有84％的同源性，成蟲來源的TPI、重組rSjTPI以及SjTPI DNA疫苗等多種形式都顯示了較好的抗感染和一定的抗病理損傷作用。先前王新軍等根據(jù)Reynolds等報(bào)道的SmTPI-P18及SmTPI-P9，設(shè)計(jì)了SjTPI同源序列部分的相應(yīng)表位SjTPI-P18及對(duì)照表位SjTPI-P9，并已鑒定SjTI-P18是C57BL/6J小鼠特異的T細(xì)胞表位。本研究中用重組rSjTPI-P

6、18T和合成SjTPI-P18刺激經(jīng)重組rSjTPI-P18免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞，檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4水平；再用高純度的合成表位肽SjTPI-P18刺激經(jīng)sjTPI-P18加完全弗氏佐劑(CFA)免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞，檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4水平。 第二部分：借鑒PDDV技術(shù)，用篩選鑒定出的Th1型抗原表位P4、P6、P18、P22及Th1型免疫佐劑CpG OD

7、N1826，構(gòu)建混合PDDV并進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。 PDDV是Wu YZ等首先在治療乙肝病毒的研究中構(gòu)建的一個(gè)新的疫苗形式，借鑒基因治療方法中陽離子肽作為DNA的非病毒載體的技術(shù)，將表位肽疫苗和DNA疫苗結(jié)合構(gòu)建的一種新的疫苗形式。本研究第一部分及本室先前工作已經(jīng)從疫苗候選分子中共篩選鑒定了4個(gè)Th1型表位肽-P4、P6、P18、P22，還篩選出種屬特異性強(qiáng)、引發(fā)C57BL/6小鼠高Th1型應(yīng)答的免疫佐劑CpG ODN1826。

8、 第三部分：混合抗原表位PDDV對(duì)血吸蟲感染小鼠肝纖維化下調(diào)-作用的研究肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展涉及多種復(fù)雜因素的刺激和調(diào)節(jié)，其根本原因是膠原的合成多于降解。主要的膠原生成細(xì)胞是肝星狀細(xì)胞(HSC)，而且纖維生成和溶解中基質(zhì)重建的主要成分是基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(MMPs/TIMPs)，MMP-9/TIMP-1平衡起關(guān)鍵作用。眾多研究表明，Th2型細(xì)胞因子能夠下調(diào)MMP-9/TIMP-1表達(dá)的平衡致使ECM沉積增多，并通

9、過對(duì)HSC活化的調(diào)節(jié)等諸多關(guān)鍵環(huán)節(jié)促進(jìn)肝纖維化發(fā)展。而以IFN-γ為主的Th1型細(xì)胞因子則能通過多種途徑抑制已活化的HSC，使其向靜息型轉(zhuǎn)變，并雙相調(diào)節(jié)MMP-9，主要對(duì)纖維化起下調(diào)作用。血吸蟲感染后形成蟲卵肉芽腫直至發(fā)生肝纖維化，存在著Th1型應(yīng)答向Th2型應(yīng)答漂移現(xiàn)象而使Th1/Th2平衡紊亂。因此通過上調(diào)Th1型應(yīng)答恢復(fù)Th1/Th2平衡，上調(diào)MMP-9/TIMP-1平衡，從而抑制HSC活化，促使ECM的溶解和重建，對(duì)減輕肝纖維化

10、發(fā)展有著重要意義。 綜上，本研究觀察到混合表位-CpG PDDV免疫的血吸蟲慢性感染小鼠，其匯管區(qū)及蟲卵肉芽腫周圍纖維增生和炎性浸潤明顯減輕，肝纖維化程度減輕；肝臟細(xì)胞因子IL-4、IL-13、TGF-β mRNA水平顯著下降，IFN-γmRNA水平上升；肝臟的蛋白表達(dá)水平上，IFN-γ表達(dá)相應(yīng)增高，MMP-9表達(dá)明顯增高，TIMP-1表達(dá)明顯下降；血清細(xì)胞因子和抗體檢測(cè)都顯示了Th1/Th2上調(diào)現(xiàn)象。并同時(shí)觀察到混合表位-Cp