肝纖維化相關(guān)基因的篩選及其功能初步研究.pdf

1、肝纖維化發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性日趨明顯,需要用更新的技術(shù)手段來闡明.cDNA微陣列技術(shù)(cDNA microarray technology),又稱基因芯片技術(shù)(gene chip technology),可同時檢測成百上千個基因的表達(dá).自從九十年代初以美國Affymetrix公司Fodor等首先開展基因芯片技術(shù)以來,該技術(shù)已被成功地應(yīng)用于基因功能研究的各個領(lǐng)域,進(jìn)行的大規(guī)?；虮磉_(dá)已成為研究病理生理過程的卓有成效的研究方法.但有關(guān)cDNA微

2、陣列技術(shù)研究肝纖維化發(fā)病機(jī)制的報(bào)道極少.應(yīng)用該技術(shù)尋找急、慢性肝損傷時差異表達(dá)的基因,將有助于闡明肝纖維化的發(fā)病機(jī)制,并為診斷和治療肝纖維化提供新的靶點(diǎn).為此我們進(jìn)行了以下研究篩選肝臟損傷相關(guān)基因,并利用RNA干擾技術(shù)初步研究其在肝纖維化中的作用.實(shí)驗(yàn)包括四部分:1)cDNA微陣列篩選急性肝損傷相關(guān)基因;2)cDNA微陣列篩選肝纖維化相關(guān)基因;3)有絲分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase

3、,MAPK)信號通路相關(guān)基因在肝纖維化形成過程中的表達(dá);4)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)基因在大鼠肝星狀細(xì)胞中的作用.實(shí)驗(yàn)方法:一.cDNA微陣列篩選急性肝損傷相關(guān)基因;雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,分別用95％肝切除術(shù)和皮下注射四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl<,4>)兩種方法制備急性肝損傷大鼠模型,隨機(jī)分為手

4、術(shù)造模組(n=10)、手術(shù)對照組(n=10)、CCl<,4>造模組(n=5)和CCl<,4>對照組(n=5).手術(shù)造模組大鼠行95％肝切除,手術(shù)對照組剖腹?fàn)坷谓M織后縫合,術(shù)后48hr肝取組織;CCl<,4>造模組大鼠皮下注射60％(v/v)CCl<,4>,CCl<,4>對照組皮下注射等體積精制橄欖油,注射后48hr取肝組織.將上述4組大鼠肝組織的mRNA提取后,制備成cDNA探針,與含1176條大鼠基因的微陣列進(jìn)行雜交及掃描,計(jì)算機(jī)數(shù)

5、據(jù)處理分析后兩組數(shù)據(jù)比較.二.cDNA微陣列篩選肝纖維化相關(guān)基因;雄性SD大鼠85只,隨機(jī)分為二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)造模組(n=20)、DMA對照組(n=15)、CCl<,4>造模組(n=30)和CCl<,4>對照組(n=20),分別用DMN和CCl<,4>誘導(dǎo)大鼠肝纖維化.DMN組于用藥1周、2周、3周分別提取肝組織總RNA,CCl<,4>組于用藥2周、4周、6周、8周分別提取肝組織總RNA,4

6、組分別分離純化mRNA,逆轉(zhuǎn)錄并用[α-<'33>P]dATP制備探針,與含1176個基因的大鼠cDNA微陣列雜交及洗滌,信號檢測,微陣列圖像分析,計(jì)算機(jī)軟件處理數(shù)據(jù),將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較.數(shù)據(jù)分析,總結(jié)與肝纖維化形成相關(guān)的信號通路.采用半定量RT-PCR驗(yàn)證部分基因的表達(dá).三.MAPK信號通路相關(guān)基因在肝纖維化形成過程中的表達(dá);采用Northern印跡法(Northern Blot)驗(yàn)證部分MAPK信號通路相關(guān)基因如ERK1、蛋白激酶

7、C-eta(protein kinase C eta type,PKC-eta)和核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,RSK)在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá);采用免疫組織化學(xué)法檢測信號通路關(guān)鍵基因-ERK在肝纖維化形成過程中蛋白水平的表達(dá)和定位及其與Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的相關(guān)性.四.ERK基因在大鼠肝星狀細(xì)胞中的作用;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測信號通路核心基因-ERK分別在原代培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞(hepatic stella

8、te cell,HSC)和活化的HSC株HSC-T6中的表達(dá)和定位.設(shè)計(jì)和合成針對ERK1 mRNA靶序列的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),構(gòu)建干擾RNA的真核表達(dá)載體,電穿孔轉(zhuǎn)入HSC-T6,G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株.對RNA干擾前后的HSC-T6,分別用RT-PCR、Western blot及免疫細(xì)胞熒光染色法檢測ERK1的表達(dá)變化;MTS檢測加入血小板衍生生長因子(platelet-d

9、erived growth factor,PDGF)前后細(xì)胞增殖情況的變化;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡指數(shù)的變化.結(jié)論:1.CCl<,4>和肝大部切除所致大鼠急性肝損傷,其再生、修復(fù)機(jī)制個有一定相似性.2.實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化形成過程中,基因轉(zhuǎn)錄水平存在許多表達(dá)差異.3.MAPK信號通路與肝纖維化的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān).4.ERK1與HSC-T6的活化、增殖密切相關(guān),通過抑制ERK1表達(dá),可能為抗肝纖維化治療提供新的靶點(diǎn).5.cDNA微陣列