超聲敏感元件的篩選及其在肝纖維化治療中的應(yīng)用.pdf

1、隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因治療已成為疾病治療的重要手段，其應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛，技術(shù)層面的可行性也不斷提高?；蛑委熗ㄟ^(guò)導(dǎo)入外源基因，使細(xì)胞表達(dá)特定產(chǎn)物，從而起到治療作用。其中，基因表達(dá)的調(diào)控是基因治療的關(guān)鍵，通過(guò)控制產(chǎn)物的表達(dá)水平，能夠在保證療效的前提下，減少潛在的毒副作用，防止意外事件發(fā)生。目前的基因調(diào)控手段主要包括光誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)以及電磁波誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)等。雖然都能在一定程度上起作用，但有各自的局限性，

2、比如處在研究前沿的光控基因表達(dá)，它雖然能夠快速調(diào)控基因表達(dá)，但卻不能到達(dá)深部組織，調(diào)控肝臟等深部器官的基因表達(dá)，起不到治療效果。超聲作為一種無(wú)創(chuàng)機(jī)械波源，可以穿過(guò)皮膚，到達(dá)深部組織，并且進(jìn)行精確空間定位，因此探討超聲敏感元件.利用超聲調(diào)控基因表達(dá)，對(duì)肝臟等深部組織疾病的基因治療具有重要意義。
　　超聲在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用廣泛，其生物學(xué)效應(yīng)主要可分為熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。利用超聲波熱效應(yīng)產(chǎn)生的熱量激活HSP70啟動(dòng)子，使其下游基因表達(dá)，這是轉(zhuǎn)基

3、因時(shí)空表達(dá)研究較多的一個(gè)領(lǐng)域。但 HSP70啟動(dòng)子的激活溫度較高，通常在43℃才有明顯基因表達(dá)增強(qiáng)，會(huì)一定程度上造成周圍組織損傷。近年來(lái)，超聲的非熱效應(yīng)逐漸受到人們的關(guān)注。已有文獻(xiàn)報(bào)道，低強(qiáng)度脈沖超聲(Low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)照射能夠影響基因表達(dá)和信號(hào)通路。超聲既然能夠激活信號(hào)通路，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，那么可以推論，存在某些特定的序列，能夠?qū)Φ蛣┝康陌踩晳?yīng)答。通過(guò)隨機(jī)合成大量啟動(dòng)

4、子序列，從中篩選，能夠找出對(duì)安全劑量超聲應(yīng)答的序列。
　　肝臟作為重要的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，能夠吞噬大量納米、微米顆粒，成為基因輸送的主要組織和基因治療的理想器官。肝纖維化是肝臟的一種慢性疾病，由肝臟損傷，修復(fù)過(guò)度所引起。在受到炎癥、損傷等刺激后，肝臟的星狀細(xì)胞激活、膠原纖維分泌增多，細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，若不及時(shí)糾正，持續(xù)性的纖維化會(huì)導(dǎo)致不可逆的肝硬化，最終還可能演變?yōu)楦伟?，極大威脅人類健康。肝纖維化過(guò)程涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子及信號(hào)通路

5、的改變，其中巨噬細(xì)胞在此過(guò)程中扮演了重要角色，不同亞型的巨噬細(xì)胞對(duì)肝纖維化有不同的作用。因此，我們?cè)O(shè)想以肝纖維化為疾病模型，通過(guò)導(dǎo)入外源基因，改變巨噬細(xì)胞的分化狀態(tài)，并通過(guò)控制外源基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控巨噬細(xì)胞功能，從而控制肝纖維化進(jìn)程。
　　據(jù)報(bào)道，CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，miR155敲除小鼠與野生型小鼠相比，纖維化程度顯著降低，且這種降低作用與巨噬細(xì)胞關(guān)系表型及功能密切。本研究擬在尋找超聲敏感元件的基礎(chǔ)上，利用超聲照射及超聲敏

6、感元件，精確調(diào)控 miR155 inhibitor的釋放，控制miR155的表達(dá)水平，從而調(diào)控單核巨噬細(xì)胞的分化，影響肝臟纖維化進(jìn)程。本研究的主要研究方法及結(jié)果如下：
　　1、構(gòu)建隨機(jī)文庫(kù)篩選超聲敏感元件
　　我們通過(guò)構(gòu)建隨機(jī)文庫(kù)進(jìn)行正向篩選。我們通過(guò)酶切、連接、克隆等分子生物學(xué)方法構(gòu)建含大量pWPI-20NminiCMV-PAC的隨機(jī)文庫(kù)，通過(guò)20N＋miniCMV誘導(dǎo)耐藥基因表達(dá)，其中PAC是指Puromycin抗性基因

7、，即嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（puromycin N-acetyl-transferase gene, PAC）。我們利用嘌呤霉素共培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，確定篩選的最佳濃度后，將構(gòu)建好的隨機(jī)文庫(kù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行超聲照射，觀察細(xì)胞狀態(tài)。篩選在嘌呤霉素中存活的細(xì)胞，提取基因組測(cè)序，對(duì)安全超聲反應(yīng)的敏感元件，為下一步基因治療提供序列。
　　2、RNA測(cè)序分析超聲照射對(duì)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞基因表達(dá)的影響
　　低

8、強(qiáng)度超聲對(duì)骨質(zhì)愈合的促進(jìn)作用被廣泛報(bào)道，已成為人們的共識(shí)?；诔晫?duì)骨折愈合的促進(jìn)作用，以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多種分化潛能和多樣的作用，我們選取小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）為研究對(duì)象，通過(guò)全骨髓貼壁法提取并培養(yǎng)C57BL6小鼠原代BM-MSCs，對(duì)MSCs進(jìn)行100 mw/cm2、15 min的超聲照射，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，利用RNA測(cè)序技術(shù)

9、分析超聲照射后小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因表達(dá)的改變，并利用分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，尋找可能對(duì)超聲敏感的調(diào)控元件。
　　3、肝纖維化模型的建立及microRNA(miRNA)的肝臟遞送
　　我們選取6周-8周齡的雄性C57BL6小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立肝纖維化模型，通過(guò)25 ml/kg的CCL4（3:7溶于橄欖油）腹腔注射，同時(shí)設(shè)置橄欖油注射組為對(duì)照，分別于造模后2周、4周、6周、8周取組織，行病理檢查，觀察造模情況。為了使m

10、icroRNA能順利到達(dá)肝臟，并進(jìn)入巨噬細(xì)胞，我們也進(jìn)行了 microRNA體內(nèi)輸送的研究。我們選取了三種不同的實(shí)驗(yàn)方法，包括殼聚糖包裹的 PLGA納米粒、商品化的超聲微泡Targesphere，以及商品化體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)染試劑Engreen，利用帶熒光的miRNA觀察不同核酸遞送系統(tǒng)的效果。結(jié)果表明，殼聚糖包裹的 PLGA納米粒很難將核酸遞送至小鼠體內(nèi)；Targesphere聯(lián)合超聲微泡爆破能夠在一定程度上將核酸輸送至小鼠肝臟；Engree

11、n對(duì)體內(nèi)轉(zhuǎn)染的效果最好。
　　4、基于超聲敏感元件的miR155精確時(shí)空干預(yù)在肝纖維化中的應(yīng)用
　　我們將篩選出的超聲敏感元件與miR155 inhibitor連接，構(gòu)建質(zhì)粒，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)miR155表達(dá)水平的調(diào)控，并將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入CCL4造模的肝纖維化小鼠體內(nèi)，利用超聲照射，調(diào)控miR155 inhibitor的表達(dá)，探討超聲對(duì)miR155 inhibitor誘導(dǎo)釋放的效果及對(duì)肝纖維化的緩解和治療作用。具體方法為將miR