調(diào)控FOXA2表達(dá)影響肝纖維化進(jìn)程的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝硬化的早期階段，是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝臟中病理性沉積的結(jié)果。各種慢性肝損傷，包括肝炎病毒感染，長(zhǎng)期酒精過(guò)量攝入，化學(xué)毒素?cái)z入（黃曲霉素B1）、代謝性或自身免疫反應(yīng)等，均會(huì)引起肝纖維。肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展可引起肝硬化，部分患者可導(dǎo)致肝癌，阻斷肝纖維化將有效逆轉(zhuǎn)該進(jìn)程，阻斷其進(jìn)一步發(fā)展。但肝纖維的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床方面缺乏公認(rèn)有

2、效的防治手段。
　　肝細(xì)胞核因子(hepatocyte nuclear factors，HNFs)家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）等，是一組在肝細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，相互作用并構(gòu)成強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在促進(jìn)肝細(xì)胞分化和功能維持方面發(fā)揮重要作用。HNF3β，即翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子FOXA2，主要表達(dá)于肝臟、胰腺、肺等。在肝臟發(fā)育及維持肝臟功能方面如糖脂代謝、膽汁酸代謝等具

3、有重要作用。前期研究利用HNF4α和HNF1α治療肝纖維化，并藉此提出利用轉(zhuǎn)錄因子治療肝纖維化的新策略。在本研究中將探討HNFs中另一個(gè)成員FOXA2對(duì)肝纖維化的可能治療作用及其作用機(jī)制。
　　在前期研究中，檢測(cè)了臨床肝纖維化病人的肝組織標(biāo)本以及四氯化碳(Carbon Tetrachloride，CCl4)肝纖維化模型的小鼠肝組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在肝纖維化組織中，F(xiàn)OXA2表達(dá)均較對(duì)照組下調(diào)。分離CCl4造模小鼠不同時(shí)期的小鼠原代肝細(xì)胞

4、及肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs)，發(fā)現(xiàn)在肝纖維化過(guò)程中，肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)逐漸下調(diào)而HSCs中的FOXA2卻逐漸升高。為進(jìn)一步探究FOXA2在肝纖維化中的作用，構(gòu)建了四種模式小鼠，結(jié)果顯示:特異性敲除肝細(xì)胞中FOXA2基因可促進(jìn)肝纖維化發(fā)生;上調(diào)肝臟中FOXA2或特異性上調(diào)肝細(xì)胞中FOXA2表達(dá)均可改善肝纖維化;但特異性上調(diào)HSCs中FOXA2對(duì)肝纖維化進(jìn)程并無(wú)顯著影響?；谇捌谘芯拷Y(jié)果，推測(cè)FO

5、XA2可能通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞來(lái)改善肝纖維化，并非通過(guò)抑制HSCs活化，但其具體機(jī)制尚未明確。
　　本課題在明確了FOXA2可有效治療肝纖維化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制。
　　方法：
　　一、CCl4誘導(dǎo)肝纖維化動(dòng)物模型的構(gòu)建
　　按3∶1比例混勻植物油和CCl4，采用腹腔注射小鼠建立肝纖維化模型，注射劑量為0.25ml/kg，每周2次，連續(xù)4至5周。
　　二、于CCl4造模不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)尾靜脈

6、注射不同病毒載體調(diào)控肝臟FOXA2表達(dá)，建立三種不同模式小鼠
　　1.肝細(xì)胞特異性敲除FOXA2的小鼠肝纖維化模型:
　　采用LoxP-Cre重組系統(tǒng)，6周齡的FOXA2loxP/loxP基因小鼠（美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室，022620）通過(guò)尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre（前期已構(gòu)建完成）2×1011Vg/只，特異性敲除小鼠肝細(xì)胞FOXA2，2周后采用CCl4腹腔注射構(gòu)建肝纖維化小鼠模型;
　　2.肝細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)FOX

7、A2的小鼠肝纖維化模型:
　　通過(guò)腺病毒載體pENN-AVV-TBG-PI-RBG（the Penn Vector Core，p1015-R）構(gòu)建具肝細(xì)胞特異性的FOXA2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)一步包裝成病毒AAV8-TBG-FOXA2（已完成）。通過(guò)尾靜脈注射至CCl4造模一周的慢性肝纖維化小鼠模型中，特異上調(diào)肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)。
　　3.肝臟過(guò)表達(dá)FOXA2的肝纖維化模式小鼠:
　　利用慢病毒載體pCDH-CMV-MCS

8、-EF1-copGFP（系統(tǒng)生物學(xué)）構(gòu)建肝臟非特異性慢病毒LV-FOXA2（已完成），通過(guò)尾靜脈注射病毒LV-FOXA2于CCl4造模兩周的慢性肝纖維化小鼠模型中，非特異上調(diào)肝臟FOXA2表達(dá)。
　　三、FOXA2對(duì)肝纖維化過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激的影響
　　分離小鼠原代肝細(xì)胞，通過(guò)Real-time RT-PCR分別檢測(cè)單純特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2和特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2后進(jìn)行CCl4造模對(duì)肝臟特異性基因的影響。<

9、br>　　利用上述三種調(diào)控FOXA2的小鼠肝纖維化模型:肝細(xì)胞特異性敲除FOXA2、肝細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)FOXA2以及肝臟非特異性過(guò)表達(dá)FOXA2模式小鼠。采用Western blot和免疫組化分析各組小鼠肝臟中CHOP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變化情況;
　　利用丙二醇(malondialdehyde，MDA)試劑盒檢測(cè)各組小鼠肝臟中MDA變化情況，通過(guò)Western blot檢測(cè)小鼠肝臟中Nitrotyrosine蛋白變化以明確氧化應(yīng)激的變化

10、情況。
　　四、FOXA2對(duì)肝纖維化過(guò)程中細(xì)胞凋亡的影響
　　使用TUNEL試劑盒檢測(cè)肝細(xì)胞特異敲除FOXA2模式小鼠肝臟標(biāo)本中的細(xì)胞凋亡情況;利用Western blot及免疫組化檢測(cè)不同模式小鼠肝組織標(biāo)本中凋亡相關(guān)基因(Bax、Cleaved caspase3)的變化情況。
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)采用軟件SPSS18進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析(ANOVA)及t

11、檢驗(yàn)等，以P＜0.05視為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　一、FOXA2可減輕肝纖維化進(jìn)程中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　1.特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2可加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)肝纖維化
　　Real-time RT-PCR結(jié)果顯示:未造模的條件下，小鼠成年后單純特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)未能影響肝細(xì)胞中肝特異基因（糖脂代謝和肝酶合成相關(guān)）的表達(dá);而小鼠經(jīng)腹腔注射CCl4進(jìn)行纖維化造模，肝特異性基因發(fā)生輕微變化;更重要的是，與對(duì)

12、照造模組相比，F(xiàn)OXA2H-KO+CCl4組小鼠原代細(xì)胞中肝特異性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下降;說(shuō)明在纖維化病理?xiàng)l件下，肝細(xì)胞中肝特異功能基因的正常轉(zhuǎn)錄需要FOXA2。
　　Western blot結(jié)果表明:單純特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2未能誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CCl4造?？蓪?dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平升高;在小鼠CCl4肝纖維化模型中，較對(duì)照造模組而言，F(xiàn)OXA2H-KO+CCl4組小鼠肝臟中CHOP表達(dá)顯著升高，提示特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2可進(jìn)

13、一步加重纖維化肝臟中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　免疫組化顯示:各組小鼠肝組織中的CHOP變化趨勢(shì)和Western blot結(jié)果一致。
　　2.特異性上調(diào)肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善肝纖維化
　　Western blot結(jié)果顯示:FOXA2組較對(duì)照組而言，肝組織中的CHOP蛋白水平明顯下降。
　　3.過(guò)表達(dá)肝臟FOXA2可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕肝纖維化
　　Western blot結(jié)果提示:CCl4造模可

14、顯著誘發(fā)小鼠肝臟內(nèi)的CHOP表達(dá)水平升高，過(guò)表達(dá)肝臟FOXA2后可抑制該蛋白水平的升高。
　　綜上，這些結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與FOXA2調(diào)控肝纖維進(jìn)程。
　　二、FOXA2可減輕肝纖維進(jìn)程中的氧化應(yīng)激
　　1.特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2可促進(jìn)氧化應(yīng)激，加重肝纖維化
　　MDA比色法及Western blot結(jié)果顯示:CCl4可輕度升高纖維化肝臟中的氧化應(yīng)激水平;在小鼠CCl4模型中，與對(duì)照造模組相比，特異性敲除

15、肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)后MDA水平及Nitrotyrosine水平顯著升高，說(shuō)明肝細(xì)胞特異性敲除FOXA2可進(jìn)一步加重纖維化肝臟中的氧化應(yīng)激水平。
　　2.特異性過(guò)表達(dá)肝細(xì)胞FOXA2可抑制氧化應(yīng)激，改善肝纖維化
　　Western blot結(jié)果顯示:FOXA2組較對(duì)照組而言，肝組織中Nitrotyrosine蛋白水平明顯減少。
　　3.過(guò)表達(dá)肝臟FOXA2可抑制氧化應(yīng)激，減輕肝纖維化
　　Western blot

16、結(jié)果提示:CCl4造模可顯著誘發(fā)小鼠肝臟內(nèi)Nitrotyrosine表達(dá)水平升高，過(guò)表達(dá)肝臟FOXA2后可抑制Nitrotyrosine蛋白的升高。
　　綜上，這些結(jié)果表明，氧化應(yīng)激參與FOXA2調(diào)控肝纖維進(jìn)程。
　　三、FOXA2調(diào)控肝纖維進(jìn)程，與肝細(xì)胞凋亡相關(guān)
　　1.肝細(xì)胞特異性敲除FOXA2通過(guò)加重肝細(xì)胞凋亡促進(jìn)肝纖維化
　　TUNEL結(jié)果顯示:單純特異性敲除肝細(xì)胞FOXA2的未造模小鼠與野生型未造模小鼠

17、相比，其肝組織中未見自發(fā)細(xì)胞凋亡;CCl4可誘發(fā)輕度細(xì)胞凋亡;更重要的是，F(xiàn)OXA2H-KO+CCl4組小鼠肝臟中細(xì)胞凋亡程度較對(duì)照造模組而言明顯加重;
　　Western blot檢測(cè)提示:FOXA2H-KO+CCl4組小鼠較對(duì)照組而言，Bax及Cleaved caspase3蛋白水平顯著升高，定量具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　免疫組織化學(xué)法顯示:與Western blot中Cleaved caspase3的變化趨勢(shì)一致，且該蛋白主

18、要定植于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中;說(shuō)明肝細(xì)胞特異性敲除FOXA2可加重纖維化肝臟中的肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝纖維化。
　　2.特異性上調(diào)肝細(xì)胞FOXA2表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，減輕肝纖維化
　　Western blot結(jié)果顯示:較對(duì)照組而言，F(xiàn)OXA2組肝組織中凋亡相關(guān)基因Bax及Cleaved caspase3表達(dá)水平均下降。
　　免疫組織染色法趨勢(shì)與Western印跡法結(jié)果一致，Cleaved caspase3染色主要位于肝細(xì)胞胞漿

19、中。
　　3.上調(diào)肝臟FOXA2表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，改善肝纖維化
　　Western blot結(jié)果提示:CCl4造模可上調(diào)小鼠肝臟內(nèi)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，而特異性上調(diào)肝細(xì)胞中的FOXA2表達(dá)后能夠抑制這些基因蛋白的升高。
　　綜上提示，F(xiàn)OXA2通過(guò)調(diào)控肝細(xì)胞凋亡影響肝纖維進(jìn)程。
　　結(jié)論：
　　一、CCl4誘導(dǎo)小鼠慢性肝纖維化損傷可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及氧化應(yīng)激，其可介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。
　　二、FOX