大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)肝纖維化大鼠細(xì)胞因子表達(dá)譜的影響及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、背景： 肝纖維化在國(guó)際疾病分類(lèi)(ICD-10)中可作為一種病名(K74.001)，但主要是一種組織病理學(xué)概念，指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)成分過(guò)度增生與異常沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)或(和)功能異常的病理變化。慢性乙型病毒性肝炎(3億)和丙型病毒性肝炎(1.7億)在世界范圍內(nèi)的流行，以及不斷增高的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcohlicsteatohepatitis，NASH)、脂肪肝病(no

2、nalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)和酒精性脂肪性肝炎(alcoholicsteatohepatitis，ASH)構(gòu)成慢性炎癥性肝病的主要原因，引起肝實(shí)質(zhì)的破壞并被疤痕組織代替，演變成肝纖維化。 目的： 觀察大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)肝纖維化大鼠模型肝纖維化程度的影響：分析大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)肝纖維化血清指標(biāo)的影響：檢測(cè)大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)對(duì)肝纖維化大鼠細(xì)胞因子GM-CSF、IL-13、IL-18、IFN-γ和瘦素表達(dá)

3、的影響；研究大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)絲裂原活化蛋白激酶通路和核因子-γB通路的影響，探討絲裂原活化蛋白激酶及NF-γB調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的可能機(jī)制。 方法： 對(duì)肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，HE染色觀察其肝纖維化程度；應(yīng)用放免法檢測(cè)肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)，透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase，HA)，層粘連蛋白(Laminin，LN)，IV型膠原(CollagenTypeIV,IV-C)，III型前膠原(ProcollagenIII，PCIII)

4、：應(yīng)用蛋白質(zhì)液相芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子GM-CSF、IFN-γ、IL-l3、IL-18和瘦素水平；應(yīng)用蛋白免疫印記分析上述藥物對(duì)絲裂原激活的蛋白激酶的表達(dá)及磷酸化水平的影響：應(yīng)用凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)研究上述藥物對(duì)NF-κB活化入核的影響，綜合分析大黃蟅蟲(chóng)丸防治肝纖維化的作用通路及調(diào)控機(jī)理。 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則應(yīng)用anova法進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05定義為有顯著性差異，并用LSD

5、法進(jìn)行組間兩兩比較；如果數(shù)據(jù)方差不齊，則應(yīng)用welch法進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05定義為有顯著性差異，應(yīng)用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料采用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 應(yīng)用光鏡觀察肝組織標(biāo)本HE染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞索排列整齊，肝索沿小葉中央靜脈呈放射狀排列，肝竇正常，細(xì)胞核圓而大，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)豐富。匯管區(qū)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)膠原纖維增生。模型

6、組肝小葉界限不清，肝竇消失。正常肝小葉結(jié)構(gòu)遭到到破壞，可見(jiàn)匯管區(qū)和小葉間有大量粗大增生的膠原纖維，組織切片中有大量假小葉形成，并且以小圓形為主。復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠肝細(xì)胞變性也以脂肪變性為主，匯管區(qū)擴(kuò)張，有纖維隔，但多數(shù)尚未連接。大黃蟅蟲(chóng)丸組病理變化較模型組顯著減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，細(xì)胞索、肝竇無(wú)明顯異常。 應(yīng)用放免法檢測(cè)肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)，與空白對(duì)照組相比，各模型組HA水平顯著升高；與模型組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大、小

7、劑量組、秋水仙堿均能降低肝纖維化大鼠的HA水平；大黃蟅蟲(chóng)丸大、小劑量組降低HA的作用優(yōu)于秋水仙堿；但與復(fù)方鱉甲軟肝片相比，無(wú)顯著差異。大黃蟅蟲(chóng)大小劑量組均能降低肝纖維化大鼠的LN水平；與正常對(duì)照組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大、小劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿的LN水平高于正常組；與秋水仙堿組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸降低LN水平；與復(fù)方鱉甲軟肝片相比，無(wú)顯著差異。與正常對(duì)照組相比，注射四氯化碳的肝纖維化大鼠IV-C顯著升高；與模型組相比，大黃蟅蟲(chóng)大、小

8、劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片均能降低肝纖維化大鼠的IV-C水平；大黃蟅蟲(chóng)丸大、小劑量組降低IV-C作用優(yōu)于秋水仙堿：與復(fù)方鱉甲軟肝片相比，無(wú)顯著差異。檢測(cè)PCIII水平，大黃蟅蟲(chóng)大、小劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片、秋水仙堿和模型組之間無(wú)顯著差異。 應(yīng)用液相蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)GM-CSF、IFN-γ、IL-13、IL-18和瘦素水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同處理組GM-CSF的水平不同，與正常對(duì)照組相比，腹腔注射四氯化碳制作肝纖維化模型提高大鼠GM

9、-CSF水平，四個(gè)處理組雖能降低GM-CSF水平，但與正常對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，存在差異；與模型組相比，大黃蟅蟲(chóng)大、小劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片均能降低肝纖維化大鼠的GM-CSF水平；與復(fù)方鱉甲軟肝片組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大、小劑量組在降低GM-CSF方面無(wú)顯著差異。 不同處理組IFN-γ的水平不同，與正常對(duì)照組相比，四氯化碳降低大鼠IFN-γ水平，四個(gè)處理組提高了IFN-γ水平，但與正常對(duì)照組相比，存在差異：與模型組相比，大黃蟅蟲(chóng)大、小

10、劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片和秋水仙堿均能提高肝纖維化大鼠的IFN-γ水平；與秋水仙堿組和大黃蟅蟲(chóng)丸組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大、小劑量組在升高IFN-γ方面無(wú)顯著差異。 對(duì)IL-13數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，提示不同處理組IL-13的水平不同，與正常對(duì)照組相比，肝纖維化模型大鼠IL-13水平升高，四個(gè)處理組均能降低IL-13水平，與正常對(duì)照組相比，存在差異；與模型組相比，大黃蟅蟲(chóng)大、小劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片均能降低肝纖維化大鼠的lLl3水平；與復(fù)方鱉甲

11、軟肝片和秋水仙堿組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸在降低IL-13水平方面，效果優(yōu)于復(fù)方鱉甲軟肝片和秋水仙堿。 研究結(jié)果表明，模型組GM-CSF顯著提高，而大黃蟅蟲(chóng)丸顯著降低其表達(dá)，與前述的研究結(jié)果一致，表明大黃蟅蟲(chóng)丸能夠通過(guò)抑制炎癥形成和抑制成纖維細(xì)胞增殖干預(yù)肝纖維化；大黃蟅蟲(chóng)丸顯著增高IFN-γ水平，抑制HSC活化，抑制成纖維細(xì)胞增殖，抑制膠原沉積；大黃蠊蟲(chóng)丸降低IL-18和lL-13水平，可能通過(guò)抑制枯否細(xì)胞激活、降低四氯化碳引起的炎癥性

12、損害；大黃蟅蟲(chóng)丸和復(fù)方鱉甲軟肝片均能降低瘦素水平防治肝纖維化。 應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印記的方法(westernblot)分析了大黃蟅蟲(chóng)丸對(duì)絲裂原活化的蛋白激酶家族成員p38、ERK和JNK及其磷酸化蛋白P-p38、P-ERK和P-JNK的表達(dá)。p38和磷酸化p38蛋白表達(dá)結(jié)果表明，不同處理組間蛋白表達(dá)水平差異有顯著性意義。與模型組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大劑量、小劑量、復(fù)方鱉甲軟肝片及秋水仙堿降低p38表達(dá)；模型組磷酸化p38表達(dá)增高，與模型

13、組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大、小劑量、復(fù)方鱉甲軟肝片及秋水仙堿降低p38表達(dá)。經(jīng)單向方差檢驗(yàn)，不同處理組間磷酸化ERK蛋白表達(dá)水平差異無(wú)顯著性意義。JNK和磷酸化JNK蛋白表達(dá)結(jié)果經(jīng)單向方差分析，表明不同處理組間蛋白表達(dá)水平差異有顯著性意義。與模型組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大劑量、小劑量、復(fù)方鱉甲軟肝片及秋水仙堿降低JNK表達(dá)；模型組磷酸化JNK表達(dá)增高，與模型組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大劑量、小劑量、復(fù)方鱉甲軟肝片及秋水仙堿降低JNK表達(dá)，差異有顯著性意義。

14、 應(yīng)用凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)研究了NF-κB活化后進(jìn)入細(xì)胞核的情況，研究發(fā)現(xiàn)模型組NF-κB活化入核顯著增強(qiáng)。與模型組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大劑量組、小劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片和秋水仙堿均能抑制NF-κB活化入核，差異有顯著性意義。與正常對(duì)照組相比，模型制作的四氯化碳升高大鼠NF-κB活化水平，大黃蟅蟲(chóng)大、小劑量組和秋水仙堿組能降低NF-κB水平，與正常對(duì)照組相比存在差異。與復(fù)方鱉甲軟肝片和秋水仙堿組相比，大黃蟅蟲(chóng)丸大、小劑量組在抑制NF-κB

15、活化水平方面，無(wú)明顯差異。 結(jié)論： 1.大黃蟅蟲(chóng)丸能夠減少炎細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維增生和肝細(xì)胞脂肪變性，改善肝小葉結(jié)構(gòu)從而減輕肝纖維化的發(fā)生； 2.大黃蟅蟲(chóng)丸能降低肝纖維化大鼠的HA、LN、IV-C和PCIII水平，其中尤以HA和IV-C明顯，提示即使剔除炎癥因素的影響，大黃蟅蟲(chóng)丸仍表現(xiàn)出良好的降低血清肝纖維化指標(biāo)的治療效果： 3.大黃蟅蟲(chóng)丸能降低GM-CSF、IL-13、IL-18和瘦素表達(dá)，增加IFN-γ

16、表達(dá)，提示可能是通過(guò)抑制炎癥形成、抑制成纖維細(xì)胞增殖并抑制膠原沉積而干預(yù)肝纖維化； 4.大黃蟅蟲(chóng)丸能降低磷酸化p38和磷酸化JNK的表達(dá)，一方面能直接降低膠原基因的轉(zhuǎn)錄，降低其合成水平，同時(shí)能增加HSC凋亡；另一方面p38和JNK磷酸化水平的降低，可能通過(guò)降低NF-κB活化入核，調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)，從而達(dá)到防治肝纖維化的作用： 5.大黃蟅蟲(chóng)丸降低NF-κB活化入核，一方面可能通過(guò)降低GM-CSF、IL-13、IL-18轉(zhuǎn)錄