大黃蟅蟲超微粉劑干預(yù)大鼠肝、腎纖維化的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景
　　 纖維化是組織、器官炎癥損傷后的常見病理轉(zhuǎn)歸,可見于多種臟器和組織,是一個(gè)涉及細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)及其降解酶類等多個(gè)復(fù)雜因素的病理生理過程。目前關(guān)于纖維化的形成機(jī)制尚不完全清楚,臨床缺乏有效的早期診斷方法和治療方法。
　　 肝腎等不同器官的纖維化,雖然發(fā)病病因與臨床表現(xiàn)不同,但其基本病理特點(diǎn)與形成機(jī)制相同。而臨床上慢性肝病也?？蓪?dǎo)致慢性腎臟病變,如乙肝相關(guān)性腎病,慢性乙型肝炎肝纖維化病變可形成免疫復(fù)合物導(dǎo)

2、致腎小球基膜增厚相關(guān)膜性腎炎,最終可導(dǎo)致腎纖維化、慢性腎衰等病變。在器官纖維化中研究對(duì)肝腎纖維化同時(shí)有效的藥物及治療方法有其特殊意義。
　　 大黃蟅蟲丸出自《金匱要略》,功能活血祛瘀、扶正補(bǔ)虛,是中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì)制定的“肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南”推薦的防治肝纖維化的中成藥。大黃蟅蟲丸臨床應(yīng)用廣泛,其抗組織器官纖維化的作用受到關(guān)注。大黃蟅蟲超微粉劑是對(duì)傳統(tǒng)丸劑的劑型改進(jìn),能減少藥量的同時(shí)提高藥效。
　　

3、中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,肝腎纖維化均存在“正虛”與“血瘀”的病機(jī)。大黃蟅蟲丸能扶正祛瘀,因此,研究同一方劑對(duì)不同臟器纖維化的作用,對(duì)于防治慢性肝病與慢性腎病,探討異病同治的內(nèi)涵有重要意義。
　　 目的
　　 研究大黃蟅蟲超微粉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化、腎纖維化的干預(yù)作用,用熒光差異凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)研究其對(duì)肝、腎纖維化大鼠肝、腎組織蛋白表達(dá)的影響,用Western免疫印跡方法及免疫組化方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,探討大黃蟅蟲超微粉

4、劑干預(yù)肝、腎纖維化的蛋白質(zhì)水平的作用機(jī)制。
　　 方 法
　　 1.大黃蟅蟲超微粉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的干預(yù)作用
　　 24只SD大鼠(雌雄各半,體重100-120g)隨機(jī)分成3組:正常組、模型組、給藥組。正常組腹腔注射等滲生理鹽水0.5 mL,其余組腹腔注射豬血清0.5 mL,每周2次,連續(xù)12周。藥物組(0.27g/kg/d)于造模之日起灌胃給藥,正常組與模型組灌服等容積生理鹽水,每天1次,連續(xù)12周。第1

5、2周末處死大鼠,取其血與肝組織。
　　 指標(biāo)檢測。肝組織病理學(xué)檢查:HE染色與Masson染色觀察其肝纖維化程度。血清纖維化指標(biāo):透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(IV-C)含量。肝功能指標(biāo):血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量。血液流變學(xué)指標(biāo):反映血液粘度的4個(gè)全血粘度值(切變率150/s、30/s、5/s、1/s)、全血高切還原粘度、全血低切還原粘度,與反映紅細(xì)胞流變性的紅細(xì)

6、胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)。
　　 2.大黃蟅蟲超微粉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用
　　 24只SD大鼠(雌雄各半,體重180-200g)隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組、模型組、給藥組。假手術(shù)組:暴露腎臟后游離左側(cè)輸尿管,然后逐層縫合；其他組:暴露腎臟后游離左側(cè)輸尿管,在腎盞處和腎下極處分別結(jié)扎輸尿管,然后逐層縫合。給藥組于造模之日起灌胃給藥,假手術(shù)組與模型組灌服等容積生理鹽水,每天1次,連續(xù)5周。第5周末處死大鼠,取其血與

7、梗阻側(cè)腎組織。
　　 指標(biāo)檢測。腎組織病理學(xué)檢查:HE染色與Masson染色觀察其肝纖維化程度。血清纖維化指標(biāo):透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(IV-C)含量。腎功能指標(biāo):血清肌酐(Cr)、尿素氮(Urea)含量。血液流變學(xué)指標(biāo):反映血液粘度的4個(gè)全血粘度值(切變率150/s、30/s、5/s、1/s)、傘血高切還原粘度、全血低切還原粘度,與反映紅細(xì)胞流變性的紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)。

8、r>　　 3.大黃蟅蟲超微粉劑對(duì)肝纖維化大鼠肝組織蛋白表達(dá)的影響
　　 采用Ettan DIGETM蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)比較肝纖維化大鼠與給予中藥治療的肝纖維化大鼠的肝組織的蛋白表達(dá)差異。蛋白樣品處理:肝組織研粉,加入DIGE用裂解液,制備肝組織全蛋白裂解液→蛋白定量:采用EttanTM2-D QuantKit定量蛋白。標(biāo)記樣品:采用CyDye DIGE最小標(biāo)記法,用不同的CyDye熒光染料標(biāo)記不同組樣品(Cy2、Cy3、Cy5

9、)。雙向凝膠電泳:固相pH梯度膠條被動(dòng)重水化14小時(shí)后用GE公司電泳儀等電聚焦電泳。等電聚焦完畢,將固相pH梯度膠條立即在平衡液中平衡,之后進(jìn)行垂直板SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,得到凝膠。圖像掃描與分析:用Typhoon掃描儀在不同波長分別對(duì)Cy2,Cy3,Cy5熒光染料標(biāo)記的圖像進(jìn)行掃描,用DeCyderImage QuantTM圖像分析軟件對(duì)DIGE圖像進(jìn)行凝膠內(nèi)差異分析,凝膠間生物學(xué)誤差分析,確定差異蛋白質(zhì),篩

10、選表達(dá)量差異2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)。制備膠與染色、酶解:制作一塊制備膠,硝酸銀染色后切下感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行酶解。質(zhì)譜鑒定:初步鑒定12個(gè)表達(dá)量差異2倍以上的蛋白點(diǎn),進(jìn)行MALDI-TOF MS/MS分析,獲得肽質(zhì)量指紋圖譜,采用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索,鑒定蛋白。蛋白功能分析和作用網(wǎng)絡(luò)分析:對(duì)于質(zhì)譜鑒定出的差異蛋白質(zhì),用蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫Swiss Prot+TrEMBL查詢相關(guān)信息,用String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)作用

11、網(wǎng)絡(luò)分析。
　　 4.大黃蟅蟲超微粉劑對(duì)肝纖維化大鼠肝組織與腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中蛋白R(shí)egucalcin、ERp57、CAⅢ表達(dá)水平的影響
　　 采用免疫印跡(Western blot)與免疫組化(Immunohistochemistry)方法對(duì)前部分實(shí)驗(yàn)中得到的差異蛋白質(zhì)Regucalcin、ERp57、CAⅢ在肝組織、腎組織中的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。免疫印跡方法:組織蛋白樣品提取,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,免疫

12、檢測及ECL化學(xué)發(fā)光,軟件進(jìn)行圖像分析及數(shù)據(jù)處理。免疫組化方法:制備組織切片,二甲苯脫蠟,乙醇水化,3％H2O2孵育,PBS液洗,加一抗,PBS液洗,加二抗,PBS液,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,中性樹膠封片,軟件進(jìn)行圖像分析及數(shù)據(jù)處理。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)滿足方差齊性檢驗(yàn),則用One-way ANOVA與LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。數(shù)據(jù)以“(x)±s”表示

13、,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié) 論
　　 1.大黃蟅蟲超微粉劑對(duì)豬血清誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有一定的干預(yù)作用:能減輕肝纖維化大鼠的肝組織損害、保護(hù)肝細(xì)胞,降低肝組織纖維化程度與血清纖維化指標(biāo)(HA、LN、PCⅢ、IV-C),改善血清肝功能指標(biāo)(ALT、AST),改善血液流變學(xué)性能與微循環(huán)。
　　 2.大黃蟅蟲超微粉劑對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)纖維化有一定的干預(yù)作用:能減輕。腎間質(zhì)纖維化大鼠的腎組織

14、損害、保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞,降低腎組織纖維化程度與血清纖維化指標(biāo)(HA、LN、PCⅢ、IV-C),改善血清腎功能指標(biāo)(Cr、Urea),改善血液流變學(xué)性能與微循環(huán)。
　　 3.大黃蟅蟲超微粉劑對(duì)肝纖維化大鼠肝組織的蛋白質(zhì)表達(dá)水平有影響。利用2D DIGE技術(shù)和MALDI-TOF MS/MS技術(shù)比較了肝纖維化大鼠與給予藥物治療的肝纖維化大鼠的肝組織蛋白質(zhì)組學(xué)差異,在58個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)(表達(dá)量差異大于2倍)中,初步鑒定了12個(gè)。這

15、12個(gè)蛋白參與機(jī)體的損傷修復(fù)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凋亡、細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)的釋放及信號(hào)傳導(dǎo)通路等機(jī)制。這12個(gè)蛋白是否參與大黃蟅蟲超微粉劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)性肝、腎纖維化的作用機(jī)制,需要進(jìn)一步研究。
　　 4.大黃蟅蟲超微粉劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化、腎間質(zhì)纖維化的部分作用機(jī)制與Regucalcin、ERp57、CAⅢ三個(gè)蛋白相關(guān)。大黃蟄蟲超微粉劑能夠調(diào)節(jié)這三個(gè)蛋白在肝纖維化大鼠肝組織及腎纖維化大鼠腎組織的表達(dá)量,而這三個(gè)蛋白通過細(xì)胞