EGCG抗大鼠肝纖維化作用及其機制的研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis)是機體對各種慢性肝臟損傷的一種動態(tài)的和固有的修復(fù)反應(yīng)。其主要病理變化是包含膠原、糖蛋白和黏著糖蛋白在內(nèi)的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝臟中過度沉積。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)被認為是慢性肝病時細胞外基質(zhì)的主要來源，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常肝臟，肝星狀細胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，貯存維生素A，位于內(nèi)皮下Dis

2、se間隙。肝纖維化時，肝星狀細胞被激活，轉(zhuǎn)化為成纖維樣細胞，細胞增殖、遷移能力增強，基質(zhì)蛋白表達增高，促進合成基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)及其抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)，導(dǎo)致間質(zhì)膠原沉積和瘢痕基質(zhì)的形成。 盡管已有多種藥物用于肝纖維化的預(yù)防和治療，但尚缺乏理想的藥物。目前迫切需要新的藥物來提高肝纖維化的治療效

3、果。表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶中的一種主要的多酚類物質(zhì)，被認為是主要的活性成分。EGCG作為一種強的抗氧化劑在治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病方面引起眾多的關(guān)注，如腫瘤、心血管疾病和纖維化。最近有研究報道EGCG可以減輕CCL4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷。體外的研究亦證明EGCG能抑制活化的HSCs增殖和膠原的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)其凋亡。上述研究表明，EGCG有望成為治療肝纖維化的有效藥

4、物，但其抗肝纖維化作用及機制尚需進一步闡明。 本研究分為整體動物實驗和細胞培養(yǎng)實驗兩個部分。 第一部分EGCG對CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的抑制作用。 目的：研究EGCG對CCL<,4>誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的抑制作用及機制。 方法：6周齡雄性SD大鼠，隨機分成4組：(1)正常對照組(n=8)，大鼠給予腹腔注射橄欖油1mL/kg(2次/周)；(2)EGCG對照組(n=8)，大鼠給予腹腔注射橄欖油1mL/kg(

5、2次/周)，同時每天腹腔注射EGCG(25mg/kg)；(3)纖維化模型組(n=12)，大鼠給予腹腔注射50﹪CCL4橄欖油溶液1mL/kg(2次/周)。(4)EGCG治療組(n=14)，大鼠給予腹腔注射50﹪CCL4橄欖油溶液1mL&g(2次/周)，同時每日給予EGCG(25mg/kg)腹腔注射。各組均于7周后處死。自動生化分析儀檢測肝功能指標(biāo)ALT和AST；HE和Massion三色染色方法對肝纖維化程度進行組織病理學(xué)分析；檢測肝組織

6、中羥脯氨酸、GSH和TBARS的含量；免疫組織化學(xué)法檢測肝組織α-SMA的表達；酶譜法檢測肝組織MMP-2的活性。 結(jié)果：組織病理學(xué)和肝組織羥脯氨酸檢測結(jié)果表明，EGCG(25mg/kg d)對CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化程度具有顯著的抑制作用。血清ALT、AST的水平顯著降低，提示對肝細胞具有保護作用。EGCG顯著抑制肝組織α-SMA的表達。EGCG能夠顯著改善CCL<,4>誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟的氧化狀態(tài)，抑制TBARS的形成和提

7、高GSH含量。同時EGCG顯著抑制肝組織MP-2的活性。 結(jié)論：EGCG具有明顯的抑制肝纖維化作用，其機制與EGCG改善大鼠肝臟的氧化狀態(tài)及抑制MMP-2的活性有關(guān)。 第二部分 EGCG對大鼠HSCs遷移及侵襲的影響。 目的：研究EGCG對大鼠HSCs遷移、侵襲及MMP-2表達和活化的影響。 方法：運用ConA(20μg/mL)刺激培養(yǎng)的HSCs，檢測不同濃度的EGCG(5、10、25、50pmol/L)

8、對MMP-2表達及活化的影響。RT-PCR和Western blotting法檢測MMP-2、TIMP-2和MT<,1>-MMP mRNA和蛋白表達的情況；明膠酶譜法測定MMP-2的活性，酶測定法檢測MT<,1>-MMP活性。劃痕實驗檢測不同濃度的EGCG對體外培養(yǎng)的HSCs遷移的作用情況。Transwell細胞培養(yǎng)小室檢測細胞侵襲。 結(jié)果：EGCG能夠顯著抑制HSCs的MMP-2 mRNA和蛋白表達。同時，EGCG呈劑量依賴性