Hint1抑制肝纖維化作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:TGF-β信號(hào)通路在肝纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,同時(shí)大量研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Hint1,三聯(lián)組氨酸核苷結(jié)合蛋白1,是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子,有研究表明Hint1能在轉(zhuǎn)錄水平抑制TGF-β和Wnt/β-catenin兩條信號(hào)通路。盡管如此,卻鮮有Hint1對(duì)肝纖維化影響的相關(guān)報(bào)道。因此,我們假設(shè)Hint1基因能通過(guò)同時(shí)抑制TGF-β和Wnt/β-catenin兩

2、條信號(hào)通路,來(lái)實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)抗肝纖維化的目標(biāo),較以前的單一靶點(diǎn)抑制具有顯著優(yōu)勢(shì)。
　　目的:通過(guò)體外過(guò)表達(dá)Hint1基因觀察其對(duì)重組Wnt3a活化的HSC-T6細(xì)胞的影響,通過(guò)體內(nèi)過(guò)表達(dá)Hint1基因觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的影響。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)采用慢病毒為載體,構(gòu)建攜帶Hint1基因全長(zhǎng)的慢病毒質(zhì)粒pGC-FU-Hint1-EGFP-3FLAG,并包裝出Hint1重組慢病毒(Lentivirus-Hint1)及其對(duì)照空載

3、體慢病毒(Lentivirus-EGFP),將其感染HSC-T6細(xì)胞,觀察過(guò)表達(dá)Hint1基因?qū)χ亟MWnt3a活化的HSC-T6細(xì)胞的影響,Western-blot檢測(cè)α-SMA、COLIA1、TGF-β1、Smad3、Smad7、β-catenin和CyclinD1蛋白表達(dá)的變化,Real-TimePCR檢測(cè)MMP-2、TIMP-1基因表達(dá)的變化。同時(shí)將Hint1重組慢病毒通過(guò)尾靜脈注射的方式導(dǎo)入大鼠體內(nèi),四氯化碳法建立肝纖維化模型,

4、造模8周后HE及Masson染色觀察肝組織的病理改變,測(cè)定羥脯氨酸評(píng)估肝組織內(nèi)膠原含量的變化,免疫組化檢測(cè)α-SMA、TGF-β1、Vimentin表達(dá)的變化,Real-TimePCR檢測(cè)纖維化相關(guān)基因表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:在體外實(shí)驗(yàn)中,Hint1基因過(guò)表達(dá)可以抑制重組Wnt3a對(duì)HSC-T6細(xì)胞的活化,降低TGF-β1、Smad3、β-catenin和CyclinD1蛋白的表達(dá),相反卻可以增加Smad7蛋白的表達(dá),同時(shí)還通過(guò)上

5、調(diào)MMP-2基因的表達(dá),下調(diào)TIMP-1基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,Hint1組較模型組肝纖維化程度明顯減輕,羥脯氨酸的含量顯著降低,α-SMA、TGF-β1、Vimentin蛋白的表達(dá)下降,肝纖維化相關(guān)基因TGF-β1、Smad3、β-catenin、CyclinD1的表達(dá)下調(diào),Smad7的表達(dá)上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而空載體組和模型組各指標(biāo)之間無(wú)明顯