冷缺血損傷對大鼠供腎致纖維化細(xì)胞因子的影響.pdf

1、研究背景和目的 腎臟移植是治療終末期腎病的最佳治療手段。雖然隨著移植手術(shù)技巧的改進，新型免疫抑制藥物的應(yīng)用，圍手術(shù)期并發(fā)癥及早期急性排斥反應(yīng)發(fā)生率明顯減低，大大增加了移植物一年的存活率，然而移植物的半壽期并未明顯提高，慢性移植性腎病受到越來越多的關(guān)注。 慢性移植性腎病是遠(yuǎn)期移植物衰竭的最常見原因，其病因既涉及免疫學(xué)因素，又涉及非免疫性損傷。非免疫方面包括冷缺血，供腎疾病，年齡，慢性神經(jīng)鈣蛋白抑制劑毒性、感染。近年來，非免

2、疫性損傷愈發(fā)受到重視。臨床上亦發(fā)現(xiàn)活體不相關(guān)供腎，短期和長期效果好于尸體供腎，說明移植時腎臟質(zhì)量和非免疫因素是關(guān)鍵。 冷缺血損傷是臨床腎移植不可避免的病理生理過程，是慢性移植性腎病的危險因素之一。冷缺血時間越長，引發(fā)術(shù)后慢性排斥反應(yīng)的可能性越大。冷缺血損害如何啟動慢性移植性腎病，其機理不清楚，可能與低溫本身損害、細(xì)胞因子、細(xì)胞代謝等多種因素有關(guān)。 腎間質(zhì)纖維化是慢性移植性腎病病理改變的主要特點。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ

3、1)是最關(guān)鍵的促纖維化生長因子，在幾乎所有研究的慢性腎臟疾病模型中，TGFβ1的表達(dá)增強，TGFβ1還是許多其它因子(如Ang-Ⅱ)引起纖維化的介質(zhì)。結(jié)締組織生長因子(CTGF)為TGFβ1的下游因子，是腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因子，在有腎小管間質(zhì)纖維化，慢性腎間質(zhì)損傷及移植排斥的病例，CTGFmRNA表達(dá)很強烈，阻斷TGF-β的表達(dá)或者可以減輕組織纖維化，但可能引起細(xì)胞生長失控，免疫失調(diào)，嚴(yán)重炎癥等副作用。因CTGF生物學(xué)效應(yīng)單一，可能

4、僅介導(dǎo)TGF-β的促纖維化效應(yīng)，因此阻斷CTGF表達(dá)可能是一種更特異，更有效的防治纖維化的手段。隨著供體短缺的矛盾日益突出，供體標(biāo)準(zhǔn)的放寬，邊緣性供體的使用，供體腎臟保存的損傷研究日益受到重視，深入研究供腎損傷的機制將有重要的積極的意義。 本研究主要目的是探討冷缺血損傷對大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)，結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)的影響，進一步闡明供腎冷缺血損傷機制。 方法： 選擇健康雄

5、性Wistar大鼠40只，按供腎冷保存時間，隨機分成5組：①冷保存0h組(對照組)，②冷保存12h組，③冷保存24h組，④冷保存36h組，⑤冷保存48h組。供腎切取采取原位灌注整塊腎臟切取，0-4℃HC-A(離體腎保存液)灌注，并置于0-4℃冰灌注液中分別保存0h，12h，24h，36h，48h，通過光鏡、透射電鏡觀察不同冷保存時間組近端腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變，并采用免疫組織化學(xué)術(shù)，原位雜交術(shù)分別檢測不同冷保存時間組近端腎小管

6、上皮細(xì)胞TGFβ1、CTGF蛋白及mRNA表達(dá)，圖像分析儀計算其陽性單位(PU)值。單因素方差分析比較多組間PU值的差異。雙變量相關(guān)分析(Pearson相關(guān)系數(shù))分析TGF-β1與CTGF蛋白表達(dá)PU值，mRNAPU值之間的相關(guān)性。 結(jié)果： 1.不同冷缺血時間近端腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變：冷保存12h組與對照組相似；冷保存24h組，部分近端腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕度水變性；冷保存36h組近端腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯水

7、變性；冷保存48h組出現(xiàn)嚴(yán)重水變性及部分近端腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落。 2.不同冷缺血時間近端腎小管上皮細(xì)胞TGFβ1、CTGF蛋白表達(dá) TGFβ1、CTGF蛋白表達(dá)均以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，TGFβ1、CTGF蛋白在冷保存0小時組，12小時組的近端腎小管上皮細(xì)胞幾乎無表達(dá)，TGFβ1蛋白表達(dá)PU值分別為6.37±2.77，6.11±1.82，兩組PU值相比較亦無差異(n=40，P=0.0878)；CTGF蛋白表

8、達(dá)PU值分別為5.91±2.30，5.57±2.40，兩組PU值相比較無差異(n=40，P=0.821)。隨著冷缺血時間延長，24h組、36h組、48h組TGFβ1蛋白PU值逐漸增高，各組PU值分別為10.20±3.27，13.84±3.91，17.17±3.96，各組相互比較，有顯著性差異(24h組與36h組相比較，n=40，P=0.031:24h組與48h組相比較，n=40，P=0.000；36h組與48h組相比較，n=40，P=0

9、.047)，與對照組、12h組相比較亦均有顯著差異(24h組與0h組相比較，n=40，P=0.024；24h組與12h組相比較，n=40，P=0.016；36h組與0h組相比較，n=40，P=0.000；36h組與12h組相比較，n=40，P=0.000：48h組與0h組相比較，n=40，P=0.000：48h組與12h組相比較，n=40，P=0.000)。24h組、36h組、48h組CTGF蛋白PU值亦逐漸增高，各組PU值分別為10.

10、25±2.92，14.31±2.83，18.11±3.94，各組相互比較，有顯著性差異(24h組與36h組相比較，n=40，P=0.012：24h組與48h組相比較，n=40，P=0.000：36h組與48h組相比較，n=40，P=0.016：)，與對照組、12h組相比較亦均有顯著差異(24h組與0h組相比較，n=40，P=0.006：24h組與12h組相比較，n=40，P=0.003：36h組與0h組相比較，n=40，P=0.000：

11、36h組與12h組相比較，n=40，P=0.000：48h組與0h組相比較，n=40，P=0.000：48h組與12h組相比較，n=40，P=0.000)。不同冷保存組TGFβ1，CTGF蛋白表達(dá)陽性單位存在正相關(guān)關(guān)系(n=40，r=0.674，P<0.05)。 3.不同冷缺血時間近端腎小管上皮細(xì)胞TGFβ1，CTGFmRNA表達(dá) TGFβ1、CTGFmRNA均以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。TGFβ1、CTGFmRNA

12、在0h組，12h組近端腎小管上皮細(xì)胞幾乎無表達(dá)，TGFβ1mRNAPU值分別為5.29±2.15，5.90±2.40，兩組PU值相比較無差異(n=40，P=0.706)。CTGFmRNAPU值分別為6.24±2.79，6.51±2.43，兩組PU值相比較無差異(n=40，P=0.889)。隨著冷缺血時間延長，24小時組、36小時組、48小時組TGFβ1mRNAPU值逐漸增高，分別為11.32±3.34，15.47±4.21，19.01±

13、3.53，各組相互比較，有顯著性差異(24h組與36h組相比較，n=40，P=0.014：24h組與48h組相比較，n=40，P=0.000；36h組與48h組相比較，n=40，P=0.035：)，與對照組、12小時組相比較亦均有顯著差異(24h組與0h組相比較，n=40，P=0.001；24h組與12h組相比較，n=40，P=0.002；36h組與0h組相比較，n=40，P=0.000；36h組與12h組相比較，n=40，P=0.00

14、0；48h組與Oh組相比較，n=40，P=0.000；48h組與12h組相比較，n=40，P=0.000)。24小時組、36小時組、48小時組CTGFmRNAPU值亦逐漸增高，PU值分別為15.24±3.95，19.20±4.73，23.09±4.40，各組相互比較有顯著性差異(24h組與36h組相比較，n=40，P=0.043；24h組與48h組相比較，n=40，P=0.000；36h組與48h組相比較，n=40，P=0.046；)，

15、與對照組、12小時組相比較亦均有顯著差異(24h組與0h組相比較，n=40，P=0.001；24h組與12h組相比較，n=40，P=0.002，；36h組與0h組相比較，n=40，P=0.000；36h組與12h組相比較，n=40，P=0.000；48h組與0h組相比較，n=40，P=0.000；48h組與12h組相比較，n=40，P=0.000)。不同冷保存組TGFβ1，CTGFmRNA陽性單位存在正相關(guān)關(guān)系((n=40，r=0.76

16、7，P<0.05)。 結(jié)論： 1.冷保存12h組與0h組供腎近端腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變相似，冷保存24h組，部分近端腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕度水變性；說明冷保存24小時前形態(tài)變化不明顯，較安全。 2.TGFβ1、CTGF蛋白及其mRNA在冷保存0小時組，12小時組的近端腎小管上皮細(xì)胞幾乎無表達(dá)，隨著冷缺血時間延長，冷保存24小時組，36小時組，48小時組TGFβ1、CTGF蛋白及其mRNA表達(dá)逐漸增高，同時冷保存2