紅花調(diào)控腎間質(zhì)纖維化大鼠腎上腺髓質(zhì)素對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化(TIF)是各種原因所致腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎功能衰竭的共同病理特征。腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的大量增殖、表型轉(zhuǎn)化，和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積是引起腎間質(zhì)纖維化的主要原因。ECM的增多又與成纖維細(xì)胞的大量增殖和其他細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，而α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)則是細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是一種多功能的細(xì)胞因子，可促進(jìn)ECM的合成，同時(shí)抑制其降解，并促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖，參與腎間質(zhì)

2、纖維化。腎上腺髓質(zhì)素(ADM)是由52個(gè)氨基酸組成的多肽，屬于一種強(qiáng)力的血管擴(kuò)張劑。近期研究表明，ADM可以抑制TGF-β1刺激膠原合成和分泌，具有抑制纖維化的作用。 中藥紅花(Saffiower)在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中具有活血祛瘀、消腫止痛的功效。ECM在腎組織中的大量聚積，用中醫(yī)理論解釋屬于腎絡(luò)瘀阻，當(dāng)用活血祛瘀法，所以采用具有活血祛瘀通絡(luò)作用的紅花治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，中藥紅花不僅可以改善血液循環(huán)，還通過其他機(jī)制減輕腎小管間質(zhì)

3、纖維化，延緩慢性腎功能衰竭的進(jìn)展。而紅花防治腎小管間質(zhì)纖維化的作用與抑制TGF-β1的表達(dá)有密切關(guān)系，但是否通過ADM抑制TGF-β1這一途徑，尚缺乏有力的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用紅花對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型進(jìn)行干預(yù)性治療，并以血管緊張素受體拮抗劑纈沙坦(Valsartan)為對(duì)照，旨在通過觀察紅花對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患側(cè)腎臟組織形態(tài)學(xué)及分子免疫學(xué)的影響，探討中藥紅花對(duì)腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用及作用機(jī)理。方法：本實(shí)驗(yàn)研究選用雌性

4、SD大鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分別置代謝籠里取尿，測定尿蛋白及尿紅細(xì)胞全部陰性，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham group)、模型組(UUOgroup)、纈沙坦組(UUOV group)、紅花組(UUOS group)，每組10只。除假手術(shù)組外，各組動(dòng)物結(jié)扎左側(cè)輸尿管并在術(shù)前1天灌胃給藥。假手術(shù)組與模型組分別灌入等量的生理鹽水，于實(shí)驗(yàn)第10天全部殺檢，取左側(cè)腎臟進(jìn)行病理學(xué)觀察，并分別采用免疫組化及原位雜交方法檢測組織中α-SMA、

5、Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)、TGF-β1和ADM的蛋白表達(dá)以及ADM mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1.腎臟一般情況、腎重/體重(KW/BW)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)檢測結(jié)果：假手術(shù)組左側(cè)腎臟形態(tài)、大小無明顯變化，模型組及各治療組左側(cè)梗阻腎臟體積均明顯增大，重量增加，腎組織變薄。模型組(0.0137±0.0045)、纈沙坦組(0.0139±0.0048)及紅花組(0.0132±0.0056)的腎重/體重比率與假手術(shù)

6、組(0.0034±0.0002)比較有顯著性差異，但模型組及各治療組之間的腎重/體重比率無顯著性差異。血尿素氮測定結(jié)果顯示，模型組(12.07±4.71)明顯高于假手術(shù)組(6.92±1.13)，纈沙坦組(8.18±1.42)、紅花組(8.61±1.61)與模型組比較顯著降低，其中纈沙坦組低于紅花組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血肌酐測定結(jié)果顯示，模型組(103.88±28.43)明顯高于假手術(shù)組(77.22±14.24)，模型組及各治療組之間比較，

7、模型組最高，紅花組(91.21±15.51)次之，纈沙坦組(85.49±20.29)最低，但三組之間無顯著性差異。 2.腎組織HE及天狼猩紅染色顯示：模型組間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤和纖維組織增生，腎小管部分萎縮、管腔閉塞或擴(kuò)張，腎小球數(shù)目明顯減少，面積縮小。腎小囊粘連或擴(kuò)張，小囊周圍大量纖維組織增生。各治療組間質(zhì)可見多少不等的炎細(xì)胞浸潤，少量纖維組織增生，腎小管輕度擴(kuò)張，部分腎小球輕度萎縮，小囊擴(kuò)張，腎小球數(shù)量無明顯改變。 3

8、.腎組織中ADM蛋白含量的測定結(jié)果：假手術(shù)組(9.587±1.83)腎組織ADM蛋白含量最高，其它各組與之相比均明顯降低。模型組(4.606±0.38)及各治療組之間比較，纈沙坦組(5.81±1.94)ADM蛋白含量最高，紅花組(4.69±0.60)次之，模型組最低，但三組之間無顯著性差異。 4.ADM蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果：假手術(shù)組大鼠在腎小管上皮細(xì)胞及腎小球內(nèi)呈弱陽性表達(dá)。與假手術(shù)組ADM的陽性面積及積分光密度值(

9、3325.7±377.78，4.49±0.38)比較，模型組(1364.75±277.43，1.18±0.13)表達(dá)顯著減弱。紅花組(2330.3±302.86，3.90±0.39)和纈沙坦組(2305.9±281.84，3.76±0.28)與模型組相比ADM的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性升高，提示紅花、纈沙坦均能上調(diào)ADM蛋白的表達(dá)。其中紅花組優(yōu)于纈沙坦組，但無顯著性差異。 5.ADM mRNA的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果

10、：假手術(shù)組大鼠的ADM mRNA在腎小管上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，模型組ADM mRNA的陽性面積及積分光密度值(294.6±46.39，1.29±0.89)與假手術(shù)組(13829.75±1224.49，10.37±0.49)相比顯著減弱。紅花組(3311.65±511.12，2.93±0.16)和纈沙坦組(3195.85±621.54，2.76±0.20)與模型組相比ADMmRNA的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性升高，提示紅花、纈沙坦

11、均能調(diào)控梗阻側(cè)腎組織中ADM的mRNA表達(dá)。其中紅花組優(yōu)于纈沙坦組，但無顯著性差異。 6.TGF-β1蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果：假手術(shù)組在腎小管上皮細(xì)胞及腎小球內(nèi)可見TGF-β1蛋白的弱陽性表達(dá)。其余各組表達(dá)均顯著增強(qiáng)，見于腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及腎小球內(nèi)。其中，模型組(20104.9±3492.40，59.61±6.69)較假手術(shù)組(1962.8±177.07，7.7±0.49)TGF-β1的陽性面積及積分光密度值均

12、呈顯著性升高。纈沙坦組(11367.3±1831.09，40.67±4.15)、紅花組(9207.9±1559.12，39.22±3.75)與模型組相比，TGF-β1的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性下降，提示紅花、纈沙坦均可抑制梗阻側(cè)腎組織中。TGF-β1的蛋白表達(dá)。其中，紅花組優(yōu)于纈沙坦組，兩組間的陽性面積有顯著性差異，而積分光密度值無顯著性差異。 7.α-SMA蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果：假手術(shù)組α-SMA僅在血管壁

13、見到陽性表達(dá)，腎間質(zhì)及腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)未見表達(dá)。模型組(19745.9±3822.25，59.07±6.11)α-SMA陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要見于腎間質(zhì)，與假手術(shù)組(1997.6±291.59，7.58±0.49)比較有顯著性差異。纈沙坦組(11369.9±1930.25，41.22±4.09)、紅花組(9141.5±1526.52，40.85±5.06)α-SMA陽性表達(dá)明顯減弱，與模型組比較有顯著性差異，提示紅花、纈沙坦均可有效

14、抑制腎間質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。紅花組α-SMA陽性表達(dá)較纈沙坦組弱，兩組間的陽性面積有顯著性差異，而積分光密度值無顯著性差異。 8.Col Ⅲ蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果：Col Ⅲ主要表達(dá)于腎間質(zhì)。假手術(shù)組大鼠腎間質(zhì)Col Ⅲ呈弱陽性表達(dá)，其余各組表達(dá)顯著增強(qiáng)，為條索狀或成片塊狀。其中，模型組(5114.5±315.69，77.44±8.86)與假手術(shù)組(455.4±34.57，10.02±0.96)相比Col Ⅲ的陽性面積及

15、積分光密度值均呈顯著性升高。纈沙坦組(3520.5±421.74，51.14±3.50)、紅花組(2406.95±375.24，43.26±3.48)與模型組相比，Col Ⅲ的陽性面積及積分光密度值均呈顯著性下降，提示紅花、纈沙坦均可抑制梗阻側(cè)腎組織中Col Ⅲ的蛋白表達(dá)。其中，紅花組明顯優(yōu)于纈沙坦組，而且有顯著性差異。 9.各組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積半定量分析結(jié)果：模型組(7448.2±922.92)腎間質(zhì)纖維化程度較假手術(shù)組(

16、854.8±92.26)明顯加重。纈沙坦組(5133.4±546.43)、紅花組(4205.8±512.19)與模型組比較，腎間質(zhì)纖維化面積明顯減少，提示紅花及纈沙坦均有拮抗腎間質(zhì)纖維化的作用。而且，紅花組明顯優(yōu)于纈沙坦組，有顯著性差異。 結(jié)論： 1.紅花能減輕腎組織的病理損害，減少病變腎組織ECM成分的積聚，延緩間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。 2.紅花能下調(diào)腎組織TGF-β1蛋白的表達(dá)，抑制腎組織中細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，減少腎間