化瘀滌痰通絡中藥調控腎上腺髓質素抑制腎小管上皮細胞表型轉化的研究.pdf

1、慢性腎衰竭在我國近年來的發(fā)病率有顯著增高的趨勢，是嚴重影響人類健康的疾病之一。目前已有大量的臨床及實驗結果表明腎間質纖維化在慢性腎臟疾病進展中具有重要作用，故有效地抑制腎間質纖維化可減緩腎臟疾病的進展。腎間質纖維化是多種慢性腎臟疾病進展至慢性腎衰竭的共同病理改變，由多種因素誘導而成，細胞增殖及表型轉化均參與這一過程并發(fā)揮著重要的作用。腎小管上皮細胞表型轉化(tubularepithelial-myofibroblasttransdiff

2、erentiation，TEMT)的概念由Strutz于1994年提出，并已被證實為腎間質纖維化的核心病理改變，其標志物為α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)。TEMT的發(fā)生機制較為復雜，與多種因素相關，單一途徑阻斷難以獲得理想效果，故尋找具有多種生理效應、多途徑抑制TEMT的藥物對減緩其進展有重要作用。腎上腺髓質素(adrenomedullin，ADM)是1993年發(fā)現(xiàn)的一種生物活性多肽，已證實該物質分布于體內多個重要臟器及組織中，腎臟是

3、ADM表達及分布較多的器官之一。ADM具有拮抗轉化生長因子β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)、血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)、抗氧化、抗炎等多種生理作用，可以拮抗多種臟器纖維化。TEMT進程中，最為重要的發(fā)生機制是轉化生長因子-β的誘導作用，故推論ADM可通過調控TGF-β、抑制TEMT從而減輕腎臟損傷，其具體作用機制有待進一步探索。ADM尚未用于臨床，中藥抑制腎間質纖維化的

4、作用是否與其相關？前期實驗研究已證實化瘀滌痰通絡中藥——腎絡通能通過抑制TGF-β1拮抗TEMT的進展，是否通過調控ADM而發(fā)揮作用尚不明確。本實驗研究采用ADM基因部分敲除小鼠(+/-)，以單側輸尿管梗阻(UUO)方法復制腎間質纖維化模型，以醛固酮受體阻斷劑依普利酮為對照藥物，觀察腎絡通對野生及ADM基因敲除小鼠腎組織中α-SMA、TGF-β1、Ⅲ型膠原(collagentypeⅢ，ColⅢ)及ADM表達的影響，探討化瘀滌痰通絡中藥抑

5、制TEMT拮抗腎間質纖維化的作用機制及其與ADM的關系，為臨床提供治療思路和實驗依據(jù)。
　　 第一部分:化瘀滌痰通絡中藥對ADM基因敲除腎間質纖維化小鼠腎功能及腎臟組織形態(tài)學的影響
　　 方法:野生及ADM基因敲除小鼠各20只均隨機分為四組，即野生小鼠分為假手術組(WT-Shamgroup)、模型組(WT-UUOgroup)、依普利酮組（WT-UUOEgroup）及中藥組（WT-UUOSgroup）四組;基因敲除小鼠同樣

6、分為假手術組（AMKO-Shamgroup）、模型組(AMKO-UUOgroup)、依普利酮組(AMKO-UUOEgroup)及中藥組(AMKO-UUOSgroup)四組。除假手術組游離左側輸尿管但不結扎外，其余各組均行左側輸尿管結扎術。中藥組給予化瘀滌痰通絡中藥腎絡通27.6g/(kg.d)經(jīng)口灌服;依普利酮組給予依普利酮混勻于飼料中按100mg/(kg.d)劑量食入。假手術組及模型組經(jīng)口灌服與中藥湯劑等劑量的生理鹽水。觀察一般情況，

7、給藥10天。于實驗結束時，稱重，斷頭取血，分離血清，分別測定血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平;摘取左側腎臟并稱重，計算各組腎重/體重比值，進行腎臟組織HE、Masson染色，觀察組織病理學改變。
　　 數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（(X)±s）表示，使用SPSS16.0forwindows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，組間比較采用單因素方差分析。顯著性差異水平以0.05和0.01為標準。
　　 結果:
　　 1.實驗小鼠腎重

8、/體重比值測定結果
　　 野生及基因敲除小鼠的模型組、依普利酮組及中藥組顯著高于相應的假手術組（P均＜0.01），但各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。(見Table1-1)
　　 2.小鼠腎組織病理形態(tài)學檢測結果
　　 HE染色顯示，野生及基因敲除小鼠中，假手術組未見明顯異常。模型組可見腎小管擴張，腎小管上皮細胞水腫，部分壞死、脫落，炎性細胞在腎間質區(qū)廣泛浸潤。Masson染色顯示，野生及基因敲除小鼠中

9、，假手術組腎臟結構未見明顯異常，小管基底膜完整，腎間質可見少量膠原成分。模型組腎組織間質膠原成分沉積顯著增多，并呈條帶狀或灶狀分布，且基因敲除小鼠重于野生小鼠。依普利酮組及中藥組間質膠原成分較模型組明顯減少，其中基因敲除小鼠較野生小鼠損傷為重。
　　 3.腎功能檢測結果
　　 Scr及BUN測定結果顯示，野生及基因敲除中各組小鼠的Scr及BUN值雖有差異，但無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。
　　 第二部分:化瘀滌

10、痰通絡中藥對ADM基因敲除腎間質纖維化小鼠α-SMA的影響
　　 方法:動物分組、模型復制、給藥方法同第一部分，共10天。實驗結束時留取腎臟，采用RT-PCR、Western-Blot、免疫組化法檢測各組小鼠腎臟α-SMAmRNA及蛋白的表達。統(tǒng)計學方法同第一部分。
　　 結果:
　　 1.腎組織α-SMAmRAN檢測結果采用RT-PCR測定α-SMAmRNA在腎組織中的表達，結果顯示，野生及基因敲除中的假手術組

11、小鼠呈弱表達，模型組表達較相應的假手術組顯著增強（P＜0.01;P＜0.01），且基因敲除模型組顯著高于野生小鼠模型組(P＜0.05)。依普利酮組及中藥組表達下調(P＜0.01;P＜0.01)。
　　 2.腎組織α-SMA蛋白檢測結果WesternBlot結果顯示，野生及基因敲除小鼠中的假手術組腎組織α-SMA蛋白表達較弱，模型組表達明顯增強，顯著高于相應的假手術組(P＜0.01;P＜0.01)，且基因敲除模型組顯著高于野生小鼠

12、模型組(P＜0.05)。依普利酮組及中藥組表達明顯低于相應的模型組(P＜0.01;P＜0.01)，中藥組與依普利酮組無明顯差異(P均＞0.05)。
　　 3.腎組織α-SMA免疫組化檢測光鏡下野生及基因敲除小鼠的假手術組僅在血管平滑肌細胞表達，腎小球、腎小管及間質未見表達;模型組中α-SMA表達明顯增多，多見于皮髓交界及皮質區(qū)的小管間質部分?；蚯贸∈竽Ｐ徒M表達尤其明顯。依普利酮組及中藥組α-SMA表達較模型組明顯減少。但基因

13、敲除小鼠表達較野生小鼠更為明顯。
　　 第三部分:化瘀滌痰通絡中藥對ADM基因敲除腎間質纖維化小鼠TGF-β1、ColⅢ的影響
　　 方法:動物分組、模型復制、給藥方法同第一部分，共10天。實驗結束時留取腎臟，采用RT-PCR、Western-Blot、免疫組化法檢測各組小鼠腎臟TGF-β1、ColⅢmRNA及蛋白的表達，并用天狼猩紅染色法測定腎臟膠原組織表達。統(tǒng)計學方法同第一部分。
　　 結果:
　　

14、1.腎組織TGF-β1、ColⅢmRNA檢測
　　 1.1TGF-β1mRNART-PCR測定結果顯示，野生及基因敲除中的假手術組小鼠呈弱表達，模型組顯著高于假手術組(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型組表達更為明顯，顯著高于野生小鼠模型組(P＜0.05);依普利酮組及中藥組明顯低于模型組(P＜0.05;P＜0.05)。
　　 1.2ColⅢmRNART-PCR測定結果顯示，野生及基因敲除中小鼠的假手術組呈極弱表

15、達，模型組顯著高于假手術組(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型組顯著高于野生小鼠模型組（P＜0.01）;依普利酮組及中藥組明顯低于相應模型組小鼠(P＜0.01;P＜0.01)。野生及基因敲除小鼠之間比較，基因敲除小鼠中藥組及依普利酮組表達均明顯高于野生型同組小鼠(P＜0.05;P＜0.05)。
　　 2.腎組織中TGF-β1及ColⅢ蛋白檢測
　　 2.1TGF-β1WesternBlot測定野生及基因敲除小鼠假

16、手術組TGF-β1蛋白少量表達，模型組表達顯著高于假手術組(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型組表達顯著高于野生小鼠模型組(P＜0.01)。依普利酮組及中藥組表達明顯低于相應模型組(P＜0.01;P＜0.01)。
　　 2.2ColⅢWesternBlot測定結果顯示，野生及基因敲除小鼠假手術組少量表達，模型組顯著高于相應的假手術組(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型組顯著高于野生小鼠模型組(P＜0.01)。野生

17、及基因敲除小鼠依普利酮組及中藥組明顯低于相應模型組(P＜0.05;P＜0.01)。野生及基因敲除兩型之間比較，基因敲除小鼠中藥組與依普利酮組均明顯高于野生型的同組小鼠（P＜0.05;P＜0.05）。
　　 3.腎組織TGF-β1及ColⅢ免疫組化檢測
　　 3.1TGF-β1免疫組化檢測野生及基因敲除小鼠的假手術組腎臟TGF-β1呈弱表達，可見于腎小球及腎小管上皮細胞;模型組TGF-β1表達明顯增強，其中基因敲除小鼠尤其

18、顯著;依普利酮組及中藥組表達較模型組明顯減少，但基因敲除小鼠較野生小鼠表達明顯。
　　 3.2ColⅢ免疫組化檢測野生及基因敲除小鼠的假手術組腎臟可見少量表達，可見于腎小球及腎小管間質;模型組ColⅢ表達明顯增多，以間質最為明顯，其中基因敲除小鼠甚于野生小鼠;依普利酮組及中藥組表達較相應模型組明顯減少，但基因敲除小鼠較野生小鼠表達明顯。
　　 4.腎臟膠原組織天狼猩紅染色測定假手術組腎間質可見膠原組織表達于腎小球、腎小管

19、及間質，野生及基因敲除小鼠間無明顯差異;模型組表達明顯增多，主要見于腎小管間質，皮質及髓質表達均明顯增強，ADM基因敲除小鼠表達尤為顯著;依普利酮組及中藥組表達較相應模型組明顯減弱，但兩組中ADM基因敲除小鼠較野生小鼠表達明顯。
　　 第四部分:化瘀滌痰通絡中藥對腎間質纖維化小鼠ADM表達的影響
　　 方法:動物分組、模型復制、給藥方法同第一部分，共10天。實驗結束時留取腎臟，采用RT-PCR、Western-Blot、

20、免疫組化法檢測各組小鼠腎臟ADMmRNA及蛋白的表達。統(tǒng)計學方法同第一部分。
　　 結果:
　　 1.腎組織ADMmRNA檢測野生及基因敲除小鼠中假手術組均有表達，但基因敲除小鼠的表達明顯低于野生小鼠(P＜0.01)。模型組顯著低于相應假手術組(P＜0.01;P＜0.01)，其中基因敲除模型組明顯低于野生小鼠模型組(P＜0.01)。依普利酮組及中藥組ADM表達明顯高于相應模型組（P均＜0.05）。
　　 2.腎組

21、織ADM蛋白檢測野生小鼠假手術組ADM表達明顯，基因敲除型假手術組表達減弱，與野生型有顯著差異（P＜0.01）;模型組ADM表達顯著低于相應假手術組（P＜0.01;P＜0.01），基因敲除模型組明顯低于野生小鼠模型組(P＜0.01)。依普利酮組及中藥組ADM表達明顯高于相應模型組(P＜0.05;P＜0.05)。
　　 3.腎組織ADM免疫組化檢測野生小鼠假手術組ADM表達較為廣泛，在皮質及髓質均有表達，且以髓質表達為明顯，基因敲

22、除小鼠假手術組表達較野生小鼠假手術組明顯減弱;兩模型組ADM表達明顯減少，髓質部減少更為明顯，且基因敲除小鼠較野生小鼠表達顯著減少，在髓質部幾無表達;依普利酮及中藥組ADM表達較相應模型組增多，其中野生小鼠表達較基因敲除小鼠為多。
　　 結論:
　　 1.結扎單側輸尿管復制腎間質纖維化實驗動物模型，腎間質膠原成分顯著增多，其中ADM基因敲除UUO小鼠較野生小鼠更為明顯。依普利酮及中藥可抑制膠原沉積，抑制作用對野生小鼠更為

23、顯著。
　　 2.腎間質纖維化實驗小鼠腎臟TEMT標志物α-SMA表達較假手術組明顯增多，其中基因敲除小鼠較野生小鼠為甚;化瘀滌痰通絡中藥及依普利酮可下調α-SMA在mRNA及蛋白水平的表達。
　　 3.化瘀滌痰通絡中藥可下調UUO腎間質纖維化模型小鼠腎組織中TGF-β1、ColⅢmRNA及蛋白的表達，減少ECM沉積。
　　 4.腎間質纖維化實驗小鼠腎臟ADM表達較假手術組顯著降低，化瘀滌痰通絡中藥可上調其表達，