益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病大鼠的干預(yù)作用及其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞ILK-a-SMA的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是以進(jìn)行性腎臟纖維化為特征的疾病，最終進(jìn)展到終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)。小管間質(zhì)病變?cè)谄渲衅痍P(guān)鍵環(huán)節(jié)，肌成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中的主要效應(yīng)細(xì)胞，而約有36％的新增纖維細(xì)胞來(lái)源于腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[1]，在病理?xiàng)l件下，腎小管上皮細(xì)胞(Renal tubular epithelial cells，RTEC)可發(fā)生上皮細(xì)胞向肌

2、成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Tubular Epithelial-myofibroblasttransdifferentiation，TEMT)，即喪失原有的上皮細(xì)胞表型特征，而獲得肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblasts，MyoF)的新特征。因此，TEMT可能在糖尿病腎病過(guò)程中起重要作用，尋找阻斷DN腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的有效途徑和方法成為國(guó)內(nèi)外重大課題。中醫(yī)藥以多靶點(diǎn)、多途徑的整體觀念和辨證論治的個(gè)體化治療方案，在DN的臨床防治中具有廣闊的

3、前景。導(dǎo)師陳志強(qiáng)教授根據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)病因病機(jī)理論并結(jié)合臨床實(shí)踐、基礎(chǔ)研究，總結(jié)DN的根本病機(jī)為氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)貫穿始終，提出以益氣養(yǎng)陰中藥為基本方，重視化瘀通絡(luò)中藥的運(yùn)用，且臨床上多重視草類藥與蟲(chóng)類藥相配伍使用，最常用丹參與地龍配伍，療效確切，鑒于草類藥與蟲(chóng)類藥皆有化瘀通絡(luò)之效，然側(cè)重不同，草類藥功之力偏弱不傷正，側(cè)重“化瘀”，蟲(chóng)類藥搜風(fēng)走竄通達(dá)，功之力偏強(qiáng)，側(cè)重“通絡(luò)”。導(dǎo)師陳志強(qiáng)教授考慮二者療效之優(yōu)勢(shì)，如單用亦能達(dá)到相同效果，可精簡(jiǎn)其

4、方，減少患者經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)以此為依據(jù)在益氣養(yǎng)陰的基礎(chǔ)上加用丹參、川芎為“化瘀組”，加用全蝎、水蛭、地龍為“通絡(luò)組”，兩組中藥進(jìn)行干預(yù)，借助糖尿病腎病動(dòng)物模型，以TEMT為切入點(diǎn)，觀察整合素連接酶(ILK)和平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)的表達(dá)，探討其與TEMT的關(guān)系及中藥組方對(duì)DN的干預(yù)作用。
　　方法：健康雄性SD大鼠40只，4～5周齡，體重125±23g，按體重隨機(jī)分為正常組(Normal group)10只，造模組30只

5、。造模組以高脂飼料聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(30mg/kg)，72小時(shí)后尾靜脈取血，測(cè)血糖連續(xù)3次≥16.7mmol/L為DM模型造模成功，造模組大鼠隨機(jī)分為模型組(Model group)，化瘀組(XYZ)及通絡(luò)組(TLZ)；均給予高脂飼料(high fat diet，HFD)，含脂類22.3％、糖44.4％、蛋白質(zhì)18.6％、水10％，其余為礦物質(zhì)和維生素等，熱卡為436kcal/100g，由河

6、北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工成顆粒飼料。正常對(duì)照組(Normal group)予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全價(jià)顆粒飼料，熱卡為351kcal/100g?；鼋M由黃芪、地黃、丹參、川芎各2袋及黃精1袋配方顆粒組成，通絡(luò)組由黃芪、地黃各2袋及黃精、地龍、水蛭、全蝎各1袋配方顆粒組成，成模后開(kāi)始給藥，各組中藥顆粒用溫水(溫度<100℃)溶解后灌胃，化瘀組予本組中藥配方顆粒劑0.92g/kg/d灌胃，通絡(luò)組予本組中藥配方顆粒劑0.77g/kg/d灌胃，余組予灌服相應(yīng)量生

7、理鹽水，日1次，共32周。于給藥第32周末，留取大鼠24 h尿液，測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的24h尿蛋白定量；尾靜脈取血測(cè)定空腹血糖(FBG)和糖化血紅蛋白(HbAlc)后；殺檢動(dòng)物，留取血、腎組織，測(cè)定血脂、腎功能、觀察腎小管間質(zhì)病理改變，免疫組化法檢測(cè)腎組織ILK與a-SMA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1各組大鼠體重、肥大指數(shù)(腎重/體重)的比較造模組與正常組相比體重明顯減輕(P<0.05)，模型組、化瘀組、通絡(luò)組之間體重?zé)o顯著差異(

8、P>0.05)；模型組與正常組相比肥大指數(shù)顯著增高(P<0.01)，而模型組與兩治療組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，提示：模型組大鼠腎臟肥大。
　　2各組大鼠24h尿蛋白定量的比較24h尿蛋白定量，造模組與正常組比較均顯著升高(P<0.01)，兩治療組與模型組比較顯著降低(P<0.01)，通絡(luò)組比化瘀組明顯下降(P<0.05)。提示：造模組大鼠出現(xiàn)尿蛋白增加且超過(guò)30mg/24h，說(shuō)明DN大鼠造模成功，早期應(yīng)用化瘀組、通絡(luò)中藥可

9、以有效減少尿蛋白的排泄，且通絡(luò)組療效優(yōu)于化瘀組。
　　3各組大鼠FBG、HbAlc、Scr、BUN的比較造模組大鼠FBG、HbAlc與正常組相比顯著升高(P<0.01)，兩治療組及模型組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；Scr、BUN水平，造模組與正常組比較均顯著升高(P<0.05)，通絡(luò)組、化瘀組與模型組相比明顯降低(P<0.05)，兩治療組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。提示：造模組大鼠存在糖代謝紊亂，腎功能受損。
　　4

10、各組大鼠血膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)的比較造模組TC、TG水平顯著高于正常組(P<0.05)，兩治療組與模型組TC、TG相比顯著下降(P<0.01)，對(duì)于TC，通絡(luò)組與化瘀組相比顯著下降(P<0.01)，對(duì)于TG，通絡(luò)組與化瘀組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示：造模組大鼠存在異常脂代謝紊亂，早期應(yīng)用化瘀組、通絡(luò)組中藥可以改善脂代謝，且通絡(luò)組降TC優(yōu)于化瘀組。
　　5腎小管及間質(zhì)病理形態(tài)學(xué)觀察模型組可見(jiàn)：部分腎小管上皮細(xì)

11、胞排列紊亂、壞死、脫落，空泡樣變性，顆粒樣變性、部分腎小管萎縮，管腔變窄，部分腎小管擴(kuò)張，小管腔可見(jiàn)絮狀物，透明管型形成，偶有蛋白管型，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基底膜增厚，腎間質(zhì)增寬，膠原纖維沉積增多，可見(jiàn)間質(zhì)纖維化。兩治療組腎小管間質(zhì)病變較模型組減輕。
　　6各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞ILK的表達(dá)ILK免疫組化檢測(cè)結(jié)果：正常組大鼠呈弱表達(dá)，主要位于遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞胞漿和臟層上皮細(xì)胞。造模組ILK的表達(dá)范圍和程度與模型組相

12、比明顯擴(kuò)大和增強(qiáng)(P<0.01)；化瘀組、通絡(luò)組ILK的表達(dá)較模型組明顯下降(P<0.05)；化瘀組與通絡(luò)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　7各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞a-SMA的表達(dá)a-SMA免疫組化檢測(cè)結(jié)果：正常組大鼠除腎血管平滑肌陽(yáng)性表達(dá)外，腎小管上皮細(xì)胞未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)；模型組、化瘀組、通絡(luò)組在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)、萎縮的腎小管周圍、腎間質(zhì)均可見(jiàn)其陽(yáng)性表達(dá)高于正常對(duì)照組(P<0.01)；與模型組比較，化瘀組和通絡(luò)組a-SMA表

13、達(dá)則明顯降低(P<0.05)；化瘀組與通絡(luò)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.化瘀組、通絡(luò)組中藥可以減輕腎小管間質(zhì)病理?yè)p害，從而延緩DN的進(jìn)展。
　　2.通絡(luò)組中藥改善DN大鼠脂代謝、減少尿蛋白的排泄優(yōu)于化瘀組。
　　3.造模組大鼠腎小管間質(zhì)a-SMA及ILK的高表達(dá)，提示二者參與、介導(dǎo)了DN的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程，并在其中起正向調(diào)控作用。
　　4.化瘀組、通絡(luò)組中藥可以下調(diào)DN大