糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及蟲草菌液對其影響.pdf

1、研究背景: 糖尿病腎病(DN)的發(fā)病率逐年上升，已成為終末期腎病(ESRD)的主要原因。其重要病理改變就是腎小管間質(zhì)病變。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在腎間質(zhì)過量堆積是其基本病理特征。腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞(MyoF)是腎間質(zhì)中產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞。在病理條件下，腎小管上皮細(xì)胞可發(fā)生上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(TEMT)，即喪失原有的上皮細(xì)胞表型特征，而獲得MyoF的新特征。有研究表明腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是腎間質(zhì)MyoF的重要來源之一，并

2、可能在DN發(fā)生發(fā)展中起重要作用。深入研究其產(chǎn)生的機(jī)制，尋找有效的阻斷TEMT的手段，具有重要意義。 在TEMT過程中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是重要的啟動和促進(jìn)因子。TGF-β1生物學(xué)作用廣泛而復(fù)雜，具有正面和負(fù)面的多樣效應(yīng)。單純抑制TGF-β1，則可能在抑制TEMT同時帶來不利的副作用。尋找其下游作用更特異、有效的因子或環(huán)節(jié)，成為了新近研究的關(guān)注熱點。 整合素連接激酶(ILK)是新近發(fā)現(xiàn)的一種與整合素細(xì)胞內(nèi)區(qū)

3、域結(jié)合的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。以往對ILK的研究主要集中在腎小球，近年在UUO模型大鼠和體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究結(jié)果表明，腎間質(zhì)ECM的聚積與ILK表達(dá)正相關(guān)；ILK介導(dǎo)TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路，可能參與TEMT過程。然而，在DN腎小管上皮細(xì)胞中ILK表達(dá)情況及其與TEMT關(guān)系，目前所知尚少。 既然TEMT在糖尿病腎病等慢性腎臟病的纖維化進(jìn)程中發(fā)揮著重要促進(jìn)作用，那么，如果能通過某些方法干擾或阻止腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程

4、，則有可能延緩或逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展。冬蟲夏草作為我國傳統(tǒng)中藥中的瑰寶，其具有滋陰補(bǔ)腎的腎臟保護(hù)作用已為大量的臨床實例所證實。冬蟲夏草是否能阻抑TEMT，減輕腎間質(zhì)纖維化從而發(fā)揮其腎保護(hù)作用?此種作用是否與ILK有關(guān)?尚未見相關(guān)報道。 本研究擬采用人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)和糖尿病大鼠模型為研究對象，從體外細(xì)胞培養(yǎng)和動物體內(nèi)實驗兩個實驗層面，采用反映上皮細(xì)胞表型特征的E鈣粘素(E-Cadherin)、反映MyoF表

5、型特征的α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和作為ECM成分的纖維連接蛋白(FN)等指標(biāo)，觀察在DN小管間質(zhì)病變中，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與ILK表達(dá)的改變，以及TEMT與ILK的關(guān)系：并用蟲草菌液干預(yù)處理，觀察蟲草菌液對上述過程的影響。旨在從TEMT這一新途徑，深入探討DN發(fā)病具體機(jī)制及冬蟲夏草腎臟保護(hù)作用的可能新機(jī)制。 方法： (一)細(xì)胞實驗部分應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，按下列實驗條件分組培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)：正常糖

6、(含5.5mM D-葡萄糖)對照組(N組)；甘露醇(含24.5mM D-甘露醇+5.5mM D-葡萄糖)對照組(M組)；高糖(含30 mMD-葡萄糖)組(H組)；高糖+蟲草菌液5μg/ml(H+5C組)；高糖+蟲草菌液10μg/ml(H+10C組)；高糖+蟲草菌液20μg/ml(H+20C組)。于48h收集各組細(xì)胞，免疫印跡方法檢測E-Cadherin、α-SMA、FN與ILK的蛋白表達(dá)。 (二)動物實驗部分雄性Wistar大鼠

7、隨機(jī)分為正常對照組(N組，n=12)、糖尿病模型組(D組，n=12)和糖尿病蟲草菌液干預(yù)組(C組，n=12)。采用腹腔內(nèi)一次注射STZ 55mg·kg-1誘導(dǎo)糖尿病模型。蟲草菌液組大鼠于糖尿病成模后，給予蟲草菌液1000mg·kg-1·d-1灌胃。分別于第8、16周末，每組隨機(jī)選取6只大鼠，留24小時尿測定尿蛋白排泄量；處死大鼠，心臟取血測血清肌酐(SCr)、血甘油三酯(TG)和膽固醇(CH)；腎臟原位灌洗后，取腎組織：石蠟切片，HE和

8、Masson染色觀察腎小管間質(zhì)損害及纖維化；免疫組化法檢測腎小管上皮細(xì)胞E-Cadherin、α-SMA、FN與ILK的表達(dá)；免疫印跡方法檢測腎組織E-Cadherin、α-SMA、FN與ILK蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1.高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞H組與N組比較，E-Cadherin的蛋白表達(dá)減少；ILK、α-SMA、FN蛋白的表達(dá)增多。經(jīng)蟲草菌液處理后的各C組與H組比較E-Cadherin的蛋白表達(dá)上調(diào)，α-SMA、FN及I

9、LK、蛋白表達(dá)下調(diào)，且與蟲草菌液呈劑量依賴性關(guān)系。 2.D組和C組糖尿病大鼠的尿蛋白排泄量、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)及間質(zhì)膠原相對面積等均隨病程進(jìn)展而增加，明顯高于同期N組；蟲草菌液(C組)能減輕上述病變。16周時C組較同期D組，其腎臟保護(hù)作用更顯著。 3.D組和C組糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)隨病程逐漸減少，而α-SMA、FN表達(dá)逐漸增加，均較同期N組有顯著差異；同時，ILK表達(dá)也明顯上調(diào)。ILK與E-C

10、adherin呈負(fù)相關(guān)，與α-SMA、FN呈正相關(guān)。蟲草菌液干預(yù)可改善上述變化，16周時C組較同期D組各指標(biāo)的改善呈現(xiàn)顯著差異。 結(jié)論: 1.高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞與糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA、FN表達(dá)增加，表明在DN腎小管間質(zhì)病變進(jìn)程中，存在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(TEMT)。 2.在DN病理狀態(tài)下，腎小管上皮細(xì)胞的ILK表達(dá)增高，且與TEMT過程高度相關(guān)；ILK參與、介導(dǎo)了