蟲(chóng)草菌液抑制CSE誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞衰老的機(jī)制研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病是一種進(jìn)展性致殘性疾病，在有害因素的刺激下，氣道和肺產(chǎn)生異常炎癥反應(yīng)。COPD的主要特點(diǎn)是持續(xù)氣流受限和不完全可逆的的氣道炎癥。
　　對(duì)COPD的細(xì)胞學(xué)、分子學(xué)以及遺傳學(xué)病因仍缺乏充分的了解，目前的治療都存在其不足，不能有效延緩疾病的進(jìn)展或降低死亡率。
　　目前的研究證實(shí)，在老齡化人群中，因衰老過(guò)程加速可同時(shí)患有有多種疾病，被稱(chēng)為共生疾病(multimorbidity)。包括COPD、冠心病、代謝性疾病以及神

2、經(jīng)系統(tǒng)退變等慢性退行性疾病，他們有著共同的發(fā)病機(jī)制，與細(xì)胞的衰老加速密切相關(guān)。
　　細(xì)胞衰老是由各種壓力導(dǎo)致不可逆的生長(zhǎng)停滯狀態(tài)的過(guò)程。老化過(guò)程中衰老細(xì)胞積聚，導(dǎo)致一系列衰老相關(guān)性疾病。研究證實(shí)，細(xì)胞衰老是共生疾病的共同原因。引起細(xì)胞衰老加速的機(jī)制涉及到端粒的縮短，PI3K/AKT/ mTor通路的活化，自噬受損，線粒體功能障礙，干細(xì)胞耗竭，免疫衰老等。很多這些途徑由慢性氧化應(yīng)激驅(qū)動(dòng)。
　　氧化應(yīng)激是引起細(xì)胞衰老的重要原因。

3、在有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)對(duì)大多數(shù)細(xì)胞都具有毒性作用。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和ROS清除系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。如果ROS產(chǎn)生增多或/和機(jī)體清除ROS能力的下降，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激(oxidative stress)。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)組織細(xì)胞ROS量相對(duì)升高，超過(guò)機(jī)體的清除能力，可導(dǎo)致機(jī)體組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，引起DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達(dá)異常，對(duì)機(jī)

4、體造成損害。在COPD患者中，氧化應(yīng)激主要來(lái)源于煙霧中的氧化劑和體內(nèi)活化的炎癥細(xì)胞，吸煙與ROS及氧化應(yīng)激密切相關(guān)。ROS活化PI3K，通過(guò)AKT激酶活化mTor，激活PI3K/AKT/ mTor通路。PI3K/AKT/ mTor通路作為細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過(guò)程。在細(xì)胞的衰老過(guò)程中，該通路也起著至關(guān)重要的作用。H3K/AKT/mTor通路活化后，通過(guò)ULK1的激活和抑制S

5、IRT1的活性，進(jìn)而加速細(xì)胞衰老。
　　綜上所述，抑制細(xì)胞衰老的加速，對(duì)COPD以及其他共生疾病有一定的治療作用。
　　近年來(lái)，從我國(guó)傳統(tǒng)中草藥中提取藥物治療慢性疾病已經(jīng)成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要組成部分。冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis)，又名蟲(chóng)草，是麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合物，是世界上目前最稀有珍貴的藥用真菌之一，有極高的醫(yī)療保健作用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，具有抗衰老、抗病

6、原微生物、抗惡性腫瘤、擴(kuò)張血管、改善動(dòng)脈硬化癥、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、呼吸、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)及腎臟和肝臟等多種功效。
　　現(xiàn)在對(duì)于蟲(chóng)草的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理作用。蟲(chóng)草中含有核苷、多糖、甾醇、蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽等，在抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。但冬蟲(chóng)夏草的具體作用機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草可以降低人肺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，抗氧化是冬蟲(chóng)夏草的重要作用機(jī)制。呼吸系統(tǒng)中的氧化應(yīng)激主要來(lái)源于煙霧，與細(xì)胞衰

7、老密切相關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)擬研究蟲(chóng)草菌液對(duì)于CSE(香煙煙霧提取物，Cigarette SmokeExtract)誘發(fā)的細(xì)胞哀老的抑制作用及其機(jī)制。從細(xì)胞分子機(jī)制延緩COPD細(xì)胞的衰老，對(duì)以后COPD病人的疾病預(yù)防及治療提供一定的價(jià)值。
　　目的：
　　1.探討CSE對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞存活率的影響。
　　2.研究CSE誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞衰老。
　　3.研究冬蟲(chóng)夏草菌液對(duì)于CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞的衰老的抑制作用。<

8、br>　　4.研究ROS和PI3K/AKT/mTor通路在CSE誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中的作用。
　　5.探討CSE和蟲(chóng)草菌液對(duì)于細(xì)胞衰老的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)進(jìn)行體外培養(yǎng)，用不同濃度CSE對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)不同時(shí)間，以MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，測(cè)定CSE對(duì)上皮細(xì)胞存活率的影響，確定最合適干預(yù)的CSE濃度和時(shí)間。
　　2.16HBE細(xì)胞經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)確定的濃度和時(shí)間的CSE干預(yù)后，通過(guò)SA

9、-β-gal染色法和P16、P21檢測(cè)細(xì)胞衰老。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶染色，計(jì)算視野中染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，P＜0.05具有顯著差異。P16和P21的檢測(cè)通過(guò)免疫熒光化學(xué)技術(shù)定性，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定mRNA相對(duì)表達(dá)，以及免疫蛋白印跡法測(cè)定蛋白表達(dá)定量。同時(shí)，以梯度CSE處理細(xì)胞，免疫蛋白印跡法測(cè)定P16和P21的蛋白表達(dá)。
　　3.在實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行CSE干預(yù)的兩小時(shí)前加入CS（蟲(chóng)草菌液，Cordy

10、ceps sinensis），細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行衰老相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。測(cè)定β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞率，免疫熒光、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)、免疫蛋白印跡測(cè)定P16、P21表達(dá)。
　　4.為測(cè)定ROS和PI3K/AKT/mTor通路的活化，16HBE細(xì)胞經(jīng)過(guò)CSE、CS處理后，通過(guò)ROS試劑盒檢測(cè)ROS熒光，定性分析不同干預(yù)條件下ROS變化;通過(guò)免疫蛋白印跡測(cè)定PI3K、AKT、mTor蛋白表達(dá)以及它們的磷酸化蛋白表達(dá);以梯度CSE處理細(xì)胞，

11、免疫蛋白印跡法測(cè)定AKT、mTor的磷酸化蛋白表達(dá)。
　　5.為了研究CSE和蟲(chóng)草菌液對(duì)于細(xì)胞衰老的作用機(jī)制，在CSE組、CS+CSE組中，我們分別加入ROS抑制劑NAC、PI3KK抑制劑Ly294002，測(cè)定ROS熒光強(qiáng)度、PI3K/AKT/mTor以及它們的磷酸化蛋白表達(dá)，以觀察加入抑制劑后對(duì)細(xì)胞通路的影響，測(cè)定β-半乳糖苷酶染色和P16、P21的蛋白表達(dá)觀察對(duì)細(xì)胞衰老的影響。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過(guò)CSE處理后

12、，16HBE細(xì)胞存活率被抑制，呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。根據(jù)MTT法繪制細(xì)胞生存率曲線，2％CSE作用24小時(shí)用于之后的干預(yù)研究。
　　2.經(jīng)過(guò)CSEE處理后，16HBE細(xì)胞的衰老增強(qiáng)。對(duì)比對(duì)照組，SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞比率增高(p＜0.05)，P16和P21的免疫化學(xué)熒光增強(qiáng)，P16和P21的mRNA相對(duì)表達(dá)增加（分別為:p＜0.05，p＜0.05），P16和P21蛋白表達(dá)量增加（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。P16和P

13、21的蛋白表達(dá)量隨CSE的作用濃度和作用時(shí)間而增加(分別為:p＜0.05，p＜0.05)。
　　3.與CSE處理細(xì)胞組進(jìn)行對(duì)比，在CSEE干預(yù)前加入CS組細(xì)胞的衰老減弱。與CSE組對(duì)比，CSE+CS組的SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞比率降低(p＜0.05)，P16和P21的免疫化學(xué)熒光減弱，mRNA相對(duì)表達(dá)減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05），蛋白表達(dá)量減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。
　　4.與對(duì)照組相比較

14、，CSE組細(xì)胞ROS熒光增強(qiáng)，PI3K、AKT、mTor蛋白表達(dá)無(wú)差異，AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)增加（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。對(duì)比CSE組，預(yù)先加入CS組細(xì)胞的ROS熒光減弱，PI3K、AKT、mTor蛋白表達(dá)無(wú)差異，AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)呈CSE濃度和時(shí)間依賴(lài)性（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。
　　5.加入ROS抑制劑N

15、AC后，CSE組、CS+CSE組細(xì)胞的ROS熒光均呈明顯減弱，AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)均減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），由此，ROS和PI3K/AKT/mTor信號(hào)通路活化降低;加入NAC后，CSE組、CS+CSE組細(xì)胞衰老減弱，表現(xiàn)為SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞的比率均有降低(分別為:p＜0.05，p＜0.05)、P16和P21蛋白表達(dá)均呈下降(分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.

16、05，p＜0.05)。
　　加入PI3K抑制劑Ly294002后，CSE組、CS+CSE組細(xì)胞的AKT、mTor磷酸化蛋白表達(dá)明顯減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），由此，信號(hào)通路活化降低，但ROS熒光變化不明顯，PI3K抑制劑對(duì)ROS影響不大;加入Ly294002后，CSE組、CS+CSE組細(xì)胞衰老減弱，表現(xiàn)為SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞的比率均有降低（分別為:p＜0.05，p＜0.05）、P

17、16和P21蛋白表達(dá)均呈下降(分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.CSE抑制人支氣管上皮細(xì)胞存活率，呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。
　　2.CSE可以誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞衰老。
　　3.CS在體外細(xì)胞培養(yǎng)中能抑制CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。
　　4.ROS和P13K/AKT/mTor信號(hào)通路在CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中起著重要的作用。
　　5.阻斷ROS/mTor信號(hào)通