自噬在慢性砷誘導的人支氣管上皮細胞轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、目的：
　　長期暴露于砷污染中時可以誘導多種腫瘤的發(fā)生。皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal Transition）是腫瘤發(fā)生的一個重要步驟，自噬是細胞用來對抗自身轉(zhuǎn)化的自我保護機制，本文旨在探討人支氣管上皮細胞BEAS-2B經(jīng)慢性亞砷酸鈉誘導后，自噬在BEAS-2B轉(zhuǎn)化中的作用。
　　方法：
　　1.BEAS-2B細胞處理
　　用2.5 ummol/L亞砷酸鈉誘導48h為急性砷誘導；用0.2

2、5ummol/L亞砷酸鈉誘導66天為慢性砷誘導；對照組 BEAS-2B相同條件無亞砷酸鈉培養(yǎng)66天；Beclin-1shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞抑制自噬；10nM雷帕霉素作用BEAS-2B細胞24h增強自噬；10nM巴弗洛霉素A1作用BEAS-2B細胞24 h抑制自噬。
　　2.集落形成實驗
　　經(jīng)0.25uM亞砷酸鈉暴露培養(yǎng)66天的BEAS-2B細胞，進行軟瓊脂集落形成實驗，14天后顯微鏡下觀察克隆形成情況，挑取細

3、胞克隆消化培養(yǎng)為轉(zhuǎn)化細胞。
　　3.自噬檢測
　　Western Blot檢測各組自噬標志蛋白Beclin-1，LC3Ⅱ，P62，觀察自噬的活性；細胞經(jīng)單丹磺酰戊二胺染色（MDC）染色,熒光顯微鏡觀察自噬小體綠色熒光信號。
　　4.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標志物和炎性體相關(guān)蛋白檢測
　　調(diào)節(jié)自噬，Western Blot檢測上皮細胞標志蛋白E-cadherin、間質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白A

4、SC表達。
　　結(jié)果：
　　1. BEAS-2B細胞經(jīng)慢性亞砷酸鈉暴露66天，克隆形成率為22.77％，較對照組（3.06%）具有顯著差異（p<0.01）；
　　2.慢性砷誘導轉(zhuǎn)化的BEAS-2B細胞，形態(tài)由上皮細胞的不規(guī)則多邊形變?yōu)樗笮?；成功建立各組細胞，獲得pDNA-Beclin1shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。
　　3.急性砷誘導組 beclin-1蛋白、LC3Ⅱ蛋白的表達最高，慢性砷誘導組beclin-1蛋

5、白、LC3Ⅱ蛋白的表達較前者下降，但仍然高于對照組；而這兩組細胞自噬降解蛋白P62的表達低于對照組。
　　4.與對照組相比，急性砷誘導組和慢性砷誘導組MDC染色顯示較強的綠色熒光信號，其中急性砷誘導組熒光信號最強。
　　5.以雷帕霉素促進自噬，上皮標志蛋白E-cadherin表達增多，而間質(zhì)標志蛋白vimentin表達下降；而以巴弗洛霉素A1抑制自噬后，結(jié)果正相反。
　　6.IL-1β成熟體與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白ASC的