Rho-ROCK信號(hào)通路在矽塵誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：以人支氣管上皮細(xì)胞株HBE為研究體系，探討矽塵是否能在體外誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞（HBE）發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型（EMT）以及Rho/ROCK信號(hào)通路在矽塵誘導(dǎo)HBE細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型中的作用機(jī)制。 方法：（1）倒置顯微鏡觀察矽塵處理后HBE細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；（2）免疫細(xì)胞化學(xué)SP法（Immunocytochemical s-p method）及Western Blot檢測(cè)不同濃度矽塵（0μg/ml，50μg/ml，100μg

2、/ml，200μg/ml，300μg/ml）處理后HBE細(xì)胞72h后上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)的改變；（3）體外劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)矽塵處理后HBE細(xì)胞遷移能力變化；（4）使用Rho活性檢測(cè)試劑盒行GSTPull-down檢測(cè)矽塵處理HBE細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)（0h，1h，2h，6h，12h，24h）Rho活性改變；（5）免疫細(xì)胞化學(xué)

3、SP法及Western Blot檢測(cè)經(jīng)不同濃度Rho/ROCK信號(hào)通路特異性抑制劑Y-27632（10μM，20μM，30μM）預(yù)處理后，矽塵誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞E-cad、Vimentin和α-SMA表達(dá)的改變，體外劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。 結(jié)果：（1）矽塵作用于HBE細(xì)胞72h后，細(xì)胞間隙增大、離散成單個(gè)，形態(tài)呈紡錘形、梭形；（2）免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，200μg/ml矽塵作用于HBE細(xì)胞，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad表達(dá)下

4、調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin和α-SMA表達(dá)上調(diào).（3）免疫印跡結(jié)果顯示，0～300μg/ml矽塵作用于HBE細(xì)胞，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad蛋白表達(dá)水平與0μg/ml組相比呈濃度依賴性降低（100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml P<0.05）；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin蛋白表達(dá)水平升高并呈濃度依賴，矽塵濃度為300μg/ml時(shí)Vimentin的表達(dá)最強(qiáng)，為0μg/ml組的（7.30±3.02）倍（P<0.05

5、）；在0～200μ g/mlα-SMA蛋白表達(dá)水平升高，矽塵濃度為200μg/ml時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，為0μg/ml組的（5.09±1.98）倍（P<0.05），矽塵濃度在200～300μg/ml時(shí)，α-SMA表達(dá)略有下降，但仍顯著高于0μg/ml組（P<0.05）；（4）矽塵作用于HBE細(xì)胞72h后行劃痕試驗(yàn)，自劃痕后6h起，處理組細(xì)胞體外劃痕愈合面積明顯大于對(duì)照組（P<0.05）。（5）矽塵作用于HBE細(xì)胞能誘導(dǎo)Rho活化，于2h開始出現(xiàn)R

6、ho活性升高，為0h組的（3.09±0.30）倍（P<0.05），于6h到達(dá)高峰，為對(duì)照組的（7.36±1.08）倍（P<0.05），之后Rho活性逐漸減弱，但仍顯著高于0h組（P<0.05）（6）干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，Y-27632（30μM）上調(diào)E-cad表達(dá)，而下調(diào)Vimentin和α-SMA表達(dá).（7）免疫印跡結(jié)果顯示，Y-27632（20，30μM）干預(yù)組，E-cad表達(dá)分別為SiO2（200μg/ml）處理組的（

7、1.98±0.38）倍和（2.17±0.51）倍（P<0.05），Vimentin和α-SMA表達(dá)減少，抑制率分別為64.32％，69.45％，和70.30％，78.37％（P<0.05）.（8）自劃痕后12h起，Y-27632（30μM）+SiO2（200μg/ml）組體外劃痕愈合面積明顯小于SiO2（200μg/ml）組（P<0.05）。 結(jié)論：（1）矽塵可誘導(dǎo)HBE細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型；（2）矽塵可活化HBE細(xì)胞的Rho