TLR4-snail信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的人膽管上皮細(xì)胞EMT中作用初步研究.pdf

1、目的：膽管病（Cholangiopathies）泛指以膽管上皮細(xì)胞（biliary epithelial cells,BECs）為主要攻擊靶點(diǎn)的一類疾病，其本質(zhì)是膽管上皮細(xì)胞受損后，上皮化的功能單位發(fā)生改建和纖維化。研究表明膽管纖維化常伴隨膽道的慢性感染。Toll樣受體4（Toll-like recepter，TLR4）作為炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵，其本身又是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的天然受體。我們

2、在前期的研究中發(fā)現(xiàn)TLR4可參與活化并激活由LPS介導(dǎo)的膽管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象，但其具體機(jī)制尚有待研究。TLR4是否是BECs發(fā)生EMT的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，以及下調(diào)TLR4能否抑制EMT，從而阻止膽道纖維化的發(fā)展？這一問(wèn)題已成為研究的熱點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)針對(duì)人膽管上皮細(xì)胞（human biliary epithelial cell lines，HIBEipC）TLR4的小干擾RNA病毒載體（LV-TLR4-RNAi），體外對(duì)HIBEpiC進(jìn)

3、行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，降低TLR4 mRNA表達(dá)，觀察LPS介導(dǎo)的EMT逆轉(zhuǎn)情況。探討LPS介導(dǎo)的EMT過(guò)程中，TLR4可能扮演的角色，以及核轉(zhuǎn)錄因子snail在EMT中可能發(fā)揮的調(diào)控作用。以期為以膽管纖維化為主要特點(diǎn)的膽道疾病的臨床藥物治療尋找新的靶點(diǎn)，和提供新的思路。
　　方法：將購(gòu)買的人膽管上皮細(xì)胞株（human biliary epithelial cell lines，HIBEpiC）進(jìn)行培養(yǎng)后，分別設(shè)立①control組（未感染

4、任何病毒的正常細(xì)胞組）；②control+LPS組（LPS誘導(dǎo)未感染病毒細(xì)胞組）；③NC+LPS組（negative control+LPS，LPS誘導(dǎo)陰性對(duì)照病毒感染組）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；④KD+LPS組（knock down+LPS，LPS誘導(dǎo) RNAi靶點(diǎn)病毒感染組）。②組將正常HIBEpiC與LPS共同培養(yǎng)；④組將TLR4的小干擾RNA病毒載體LV-TLR4-RNAi轉(zhuǎn)染至正常HIBEpiC，收集感染率＞80％的細(xì)胞與LPS共同培養(yǎng)；③

5、組用陰性病毒CON077相同步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和LPS刺激。分別取0h、14h、24h、48h和72h等不同時(shí)相點(diǎn)，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后，膽管上皮細(xì)胞E-cadherin、TLR4和snail mRNA水平表達(dá)變化情況。①、②、③、④組分別進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1. LPS誘導(dǎo)正常HIBEpiC，14h、24h、48h、72h后細(xì)胞

6、間排列變得松散，細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形改變，細(xì)胞突起增多。隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)越接近成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。而刺激慢病毒轉(zhuǎn)染后的HIBEpiC，相同時(shí)相觀察細(xì)胞接近正常上皮樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞大小基本一致，細(xì)胞形態(tài)各異，呈圓形、橢圓形、多邊形等。提示：TLR4-siRNA可抑制LPS誘導(dǎo)的HIBEpiC發(fā)生EMT。
　　2. LPS刺激HIBEpiC后14h即可檢測(cè)到TLR4 mRNA表達(dá)量較正常HIBEpiC明顯升高（P＜0.01），隨培養(yǎng)時(shí)

7、間延長(zhǎng)，一直維持在較高水平。而④組經(jīng)LV-TLR4-RNAi病毒轉(zhuǎn)染的HIBEpiC，在LPS刺激下可檢測(cè)到TLR4 mRNA表達(dá)下降，0h、14h、24h、48h和72h敲減效率分別為73.5%、81.5%、89.9%、93.9%和82.6%；LPS刺激TLR4-siRNA后的HIBEpiC，0h即出現(xiàn)TLR4 mRNA表達(dá)量較③組明顯下降，至72h未見升高趨勢(shì)（P＜0.01）。結(jié)果說(shuō)明病毒轉(zhuǎn)染成功，TLR4-siRNA可特異性沉默T

8、LR4 mRNA表達(dá)。
　　3. LPS刺激HIBEpiC，14h后可觀察到鋅指轉(zhuǎn)錄因子snail較正常細(xì)胞的表達(dá)量升高，繼續(xù)培養(yǎng)至24h、48h，其表達(dá)仍維持較高水平（P＜0.01）。同樣與③組比較，TLR4-siRNA的HIBEpiC，snail的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量降低，14h、24h、48h最明顯（P＜0.01）。說(shuō)明TLR4-siRNA可下調(diào)snail在HIBEpiC上的表達(dá)。
　　4. LPS刺激可誘導(dǎo)H

9、IBEpiC發(fā)生EMT現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平受到明顯抑制，②組經(jīng)LPS刺激，14h起至72h內(nèi)，可觀察到E-cadherin表達(dá)持續(xù)下降（P＜0.01）。而在TLR4-siRNA干擾后，與③組間比較，TLR4被阻斷14~48h均能檢測(cè)到E-cadherin的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)（P＜0.01）。說(shuō)明TLR4-siRNA干擾后可抑制E-cadherin下調(diào)。
　　5. LPS刺激陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染后的HIB

10、EpiC，各時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)到的EMT相關(guān)目的基因表達(dá)情況與②組表達(dá)情況基本相符，P＞0.05差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明病毒載體本身對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默TLR4基因表達(dá)，可有效抑制LPS誘導(dǎo)的膽管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT表型轉(zhuǎn)化；
　　2.沉默TLR4的HIBEpiC中，上皮標(biāo)志物明顯升高，EMT現(xiàn)象受到了明顯的抑制；
　　3.轉(zhuǎn)錄因子snail是EMT過(guò)程中重要的信號(hào)分子，在模擬的膽