腎康注射液抑制高糖誘導腎小管上皮細胞應激性衰老.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是導致終末期腎功能衰竭的主要原因。腎小管間質(zhì)在DN進展中扮演了重要角色，近端腎小管上皮細胞作為最易受損的腎實質(zhì)細胞，在葡萄糖代謝紊亂環(huán)境中極易發(fā)生缺氧，氧化應激損傷，表現(xiàn)為先增生后肥大繼而應激性衰老。近期大量研究表明，DN早期患者腎組織中便出現(xiàn)衰老腎小管上皮細胞，同時在糖尿病早期大鼠模型腎組織中也有大量衰老腎小管上皮細胞，體外實驗亦證實高糖可加速腎小管上皮細胞

2、應激性衰老，說明腎小管上皮細胞應激性衰老是DN腎小管間質(zhì)損傷早期的重要細胞生物學事件。研究發(fā)現(xiàn)衰老的腎小管上皮細胞與腎小管萎縮，腎間質(zhì)炎癥，腎間質(zhì)纖維化，及腎功能密切相關，并且衰老的腎小管上皮細胞可增加腎臟對損傷刺激的易感性，抑制正常細胞增殖從而阻止受損腎臟的修復。因此腎小管上皮細胞應激性衰老在DN進展中扮演了重要角色，防治腎小管上皮細胞應激性衰老可能是延緩DN進展的一個新策略。
　　經(jīng)典方藥腎康注射液是由黃芪、大黃、丹參和紅花四

3、種中藥組成的復方制劑。腎康注射液(國藥準字Z20040110)，于1999年經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(YBZ08522004)用于治療慢性腎臟病。經(jīng)過大量臨床試驗研究，發(fā)現(xiàn)腎康注射液可明顯降低CKD患者的血肌酐，尿素氮水平，保護殘余腎功能，具有良好的有效性，安全性和遠期療效。體內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)腎康注射液可以顯著抑制腎臟氧化應激損傷，抑制腎間質(zhì)纖維化。已有體外研究證明腎康注射液能夠顯著抑制高糖誘導后系膜細胞肥大和P21表達等衰老細胞特征

4、樣改變，提示腎康注射液具有抑制高糖誘導系膜細胞衰老的作用。因此，我們的研究關注腎康注射液是否具有抑制高糖誘導腎小管上皮細胞衰老的作用及機制。
　　方法：
　　1.原代腎小管上皮細胞提取及鑒定
　　1.1取3周齡雄性C57小鼠斷頸處死，無菌獲取雙腎，去除腎包膜和腎蒂組織，加入Ⅱ型膠原酶37°消化30min，通過雙重過濾(依次通過250uM和80uM篩網(wǎng))，置入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　1.2利用免疫熒光

5、技術檢測細胞CK-18和villin的表達鑒定腎小管上皮細胞的純度。
　　2.建立高糖刺激腎小管上皮細胞衰老模型
　　高糖(30mmol/L)刺激第二代腎小管上皮細胞72h后(設等滲透壓甘露醇對照組、正常糖濃度對照組)后，觀察細胞形態(tài)及免疫熒光染色P16、DcR2和SA-β-Gal觀察細胞衰老情況。
　　3.明確腎康注射液能否抑制高糖刺激后腎小管上皮細胞衰老
　　實驗分組:①正常對照組;②30mmol/L高糖組;

6、③等滲透壓甘露醇組;④30mmol/L高糖+50mg/L腎康注射液;⑤30mmol/L高糖+100mg/L腎康注射液;⑥30mmol/L高糖+200mg/L腎康注射液;⑦5mmol/L正常糖+200mg/L腎康注射液。
　　腎康注射液和高糖培養(yǎng)腎小管細胞72h后，觀察細胞形態(tài)及免疫熒光染色檢測各組衰老指標:SAHF、p16、cyclinD1、DcR2和SA-β-Gal表達情況。
　　4.探明腎康注射液抑制高糖刺激后腎小管上皮

7、細胞衰老的機制
　　實驗分組:①正常對照組;②30mmol/L高糖組;③等滲透壓甘露醇組;④30mmol/L高糖+200mg/L腎康注射液;⑤5mmol/L正常糖+200mg/L腎康注射液;
　　腎康注射液和高糖培養(yǎng)腎小管細胞72h后，利用試劑盒檢測各組MDA含量和SOD活性。利用PCR、western blot檢測各組Klotho、Sirt1、PPAR-γ、p66Shc以及mTOR的表達水平。
　　5.統(tǒng)計學分析

8、r>　　采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，對于符合正態(tài)分布的組間比較進行單因素方差分析(ANOVA)，結(jié)果以P＜0.05為相差顯著。
　　結(jié)果：
　　1.高糖組腎小管上皮細胞明顯扁平肥大，衰老標志p16Ink4，SAHF，cyclinD1，DcR2和SA-β-Gal明顯上調(diào)，甘露醇作為等滲對照組并未引起腎小管上皮細胞衰老。而腎康注射液可以顯著下調(diào)衰老標志p16Ink4，SAHF，cy

9、clinD1，DcR2和SA-β-Gal的表達，使細胞形態(tài)趨于正常，具有良好的量效關系。腎康注射液可以顯著緩解高糖誘導腎小管上皮細胞衰老指標的表達，說明腎康注射液可以抑制高糖誘導后腎小管上皮細胞的衰老，呈現(xiàn)良好的劑量依耐性。
　　2.高糖組腎小管細胞MDA含量明顯上調(diào)而SOD活力明顯下降，而腎康注射液可以顯著下調(diào)MDA含量明顯上調(diào)SOD活力，提示腎康注射液具有抗氧化應激的作用。
　　3.高糖組腎小管細胞mTOR和P66shc

10、促衰老分子表達上調(diào)， Klotho，Sirt1，PPAR-γ抗衰老分子表達下調(diào)，而腎康注射液可以顯著下調(diào)mTOR和P66shc促衰老分子，顯著增加Klotho，Sirt1，PPAR-γ抗衰老分子表達。腎康注射液通過抑制p66Shc、mTOR的表達，上調(diào)Klotho、Sirt1、PPAR-γ的表達抑制高糖誘導腎小管上皮細胞的衰老。
　　結(jié)論：
　　本研究證明了腎康注射液具有抑制高糖誘導腎小管上皮細胞應激性衰老的作用，這一作用可