CTNNAL1對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞粘附功能的影響.pdf

1、國(guó)內(nèi)外及本實(shí)驗(yàn)室多項(xiàng)研究證實(shí)，粘附分子在氣道炎癥及損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)的粘附分子參與氣道上皮對(duì)應(yīng)激刺激的應(yīng)答，表現(xiàn)為:通過(guò)與基質(zhì)的結(jié)構(gòu)性粘附維持上皮的結(jié)構(gòu)完整，并參與細(xì)胞的抗氧化、增殖遷移和損傷修復(fù)功能;通過(guò)與白細(xì)胞的炎癥性粘附激活傳遞炎癥或應(yīng)激信號(hào)[1-3]。
　　 本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)連環(huán)素(catenin)家族中的CTNNAL1（catenin alpha-like1）基因在哮喘病人的外周血和支氣管

2、粘膜中表達(dá)下調(diào)，提示其與哮喘相關(guān)，但是在在急性應(yīng)激的動(dòng)物模型及培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞（human bronchial epithelial cells，HBECs）損傷邊緣高表達(dá)，提示CTNNAL1可能參與氣道應(yīng)激反應(yīng)，參與維持氣道上皮的完整，其表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致上皮功能缺陷及完整性破壞。因此，為探討CTNNAL1在氣道上皮應(yīng)激反應(yīng)中的功能意義，本課題擬研究CTNNAL1對(duì)HBECs粘附功能的影響。
　　 目的:
　　 觀

3、察不同表達(dá)水平的CTNNAL1對(duì)HBECs增殖和粘附功能以及部分粘附分子表達(dá)的影響，初步探討CTNNAL1在氣道上皮應(yīng)激反應(yīng)中的功能意義。
　　 方法:
　　 (1)構(gòu)建CTNNAL1不同表達(dá)水平的重組質(zhì)粒，用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HBECs，建立穩(wěn)定細(xì)胞系。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞系中CTNNAL1的表達(dá)。
　　 (2)將CTNNAL1不同表達(dá)水平的HBECs系用細(xì)胞核熒光染料碘化丙

4、啶(PI)進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　 (3) MTT法檢測(cè)CTNNAL1不同表達(dá)水平的HBECs系與鼠尾膠原的基質(zhì)性粘附能力。
　　 (4)用FITC標(biāo)記人WBC的CD45分子，與CTNNAL1不同表達(dá)水平的HBECs系粘附，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)粘附的WBC的數(shù)量，反映各種HBECs系的炎癥性粘附能力。
　　 (5)采用RT-PCR觀察CTNNAL1不同表達(dá)水平的HBECs系中上皮鈣粘附素(E-ca

5、dherin)和細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1）的表達(dá)變化。
　　 (6) ELISA法檢測(cè)各組HBECs系中IL-8的分泌量。
　　 結(jié)果:
　　 (1)成功構(gòu)建pcDNA3.1(-)-cyc-his/CTNNAL1高表達(dá)質(zhì)粒和pGCsilencerU6/Neo/RFP/CTNNAL1-RNAi沉默質(zhì)粒，并以此分別轉(zhuǎn)染-BECs，成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，與空載體相比，pcDNA3.1(-)-cyc-his/CT

6、NNAL1重組質(zhì)粒的HBECs系中CTNNAL1mRNA水平及蛋白水平均顯著升高;與陰性對(duì)照質(zhì)粒的HBECs系相比，CTNNAL1-RNAi沉默質(zhì)粒的HBECs系中CTNNAL1 mRNA水平及蛋白水平均顯著降低。
　　 (2) CTNNAL1高表達(dá)HBECs系增殖活躍，表現(xiàn)為(G2+S)/G1細(xì)胞百分比增加199.84％。
　　 (3) CTNNAL1高表達(dá)增強(qiáng)了HBECs對(duì)基質(zhì)的粘附能力，CTNNAL1沉默后降低了H

7、BECs的基質(zhì)粘附率，且在30 min，120 min有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (4) CTNNAL1高表達(dá)使HBECs與人總WBC的炎性粘附細(xì)胞百分比降低了35.3％。
　　 (5) CTNNAL1高表達(dá)增加了HBECs中粘附分子E-cadherinmRNA水平的表達(dá)(56.5％)，降低了ICAM-1的表達(dá)(90.4％);CTNNAL1沉默后降低了E-cadherin mRNA水平的表達(dá)(59.9％)。
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