煙草煙霧冷凝物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞Rap2B基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：觀察煙草煙霧冷凝物(cigarette smoke condensate,CSC)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)Rap2B基因表達(dá)的影響及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的變化:1、觀察CSC急性染毒后16HBE細(xì)胞的毒性特征及對(duì)Rap2B基因表達(dá)的影響,推測(cè)Rap2B基因在急性染毒階段的作用,為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2、觀察Rap2B基因在CSC致16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的變化情況,探索Rap2B基因在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用。3、

2、觀察CSC染毒16HBE細(xì)胞后全基因組甲基化水平及Rap2B基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的變化情況。
　　 方法：1、設(shè)置溶劑對(duì)照(DMSO)、CSC0.04mg/ml、0.06 mg/ml、0.08 mg/ml、0.12 mg/ml、0.15 mg/ml、0.18 mg/ml、0.24 mg/ml、0.30 mg/ml9個(gè)劑量組,染毒24 h后,采用CCK-8法測(cè)定終點(diǎn),通過SPSS15.0軟件計(jì)算IC50。16HBE細(xì)胞暴露不同劑量C

3、SC(CTRL、DMSO、1/8 IC50、1/4 IC50、1/2 IC50、1 IC50)4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,熒光定量PCR檢測(cè)Rap2B基因mRNA表達(dá)水平,Western Blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平。2、根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置溶劑對(duì)照組和1/8 IC50劑量組,重復(fù)染毒30代,每代細(xì)胞染毒24h,通過染色體畸變分析、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)鑒定16HBE細(xì)

4、胞的惡性轉(zhuǎn)化程度及檢測(cè)mRNA和蛋白表達(dá)水平。3、以聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制性內(nèi)切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)的方法檢測(cè)全基因組甲基化情況的變化:亞硫酸氫鹽測(cè)序(bisulfite genomic sequencing,BGS)的方法檢測(cè)Rap2B基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況的變化。
　　 結(jié)果：1、CSC對(duì)16HBE細(xì)胞有毒性作用,通過軟件計(jì)算CSC染毒16HBE細(xì)

5、胞24 h的半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration50％,IC50)為0.08±0.006mg/ml。設(shè)置對(duì)照組(CTRL)、DMSO組、0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.04 mg/ml、0.08 mg/ml6個(gè)實(shí)驗(yàn)組。16HBE細(xì)胞暴露CSC24 h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生一定改變,高劑量組細(xì)胞變?yōu)椴灰?guī)則形狀;染毒20 h及24 h后,0.01 mg/ml與0.02 mg/ml劑量組Rap2B基因mRN

6、A和蛋白表達(dá)水平上調(diào),與DMSO組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),隨劑量組濃度增高,在0.08 mg/ml組mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)至最低,與DMSO組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2、隨著染毒次數(shù)的增加,16HBE細(xì)胞染色體畸變率逐漸增加,P20與P30代細(xì)胞染色體畸變率分別為12%與18%,與對(duì)照組比較與統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P30代細(xì)胞的克隆數(shù)與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

7、<0.05);裸鼠腫瘤形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射P30代細(xì)胞14 d后可以發(fā)現(xiàn)肉眼可見腫瘤,至注射后28 d的形成明顯腫瘤組織;慢性過程中P30代細(xì)胞Rap2B基因mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平穩(wěn)步增加,與DMSO組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3、慢性轉(zhuǎn)化過程中各代細(xì)胞全基因組總體甲基化變化情況,ALU片段:P10(14.8%)、P20(12.8%)、P30(13.1%)與DMSO組(13.0%)比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、(P>0.05)。LINE-1片段:P10(55.3%)P20(49.8%)、P30(49.3%)與DMSO組(53.4%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),LINE-1甲基化率呈下降趨勢(shì);Rap2B基因啟動(dòng)子區(qū)表現(xiàn)出低甲基化。
　　 結(jié)論：1、Rap2B基因的表達(dá)在一定濃度范圍內(nèi)具有劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)問效應(yīng)關(guān)系;隨著染毒濃度的改變呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),提示Rap2B基因可能作為CSC靶基因在其急性染毒過程中一定的作用。