益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方對糧尿病腎病大鼠足細胞的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病最主要的原因之一，臨床上以蛋白尿為主要表現(xiàn)。1型和2型DM均可發(fā)生DN，嚴重影響DM患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，因此，探討DN的發(fā)病機制，尋求防治DN的有效方法具有重要意義。DN的發(fā)生發(fā)展是多種因素綜合作用的結(jié)果，具有復(fù)雜的病理機制，盡管國內(nèi)外學(xué)者不斷探索DN的防治方法，但是到目

2、前為止，仍然缺乏防治DN的特效方法。而中醫(yī)藥以其獨特的辨證論治體系，多靶點的整體調(diào)節(jié)功能，以及三因制宜的個性化治療方案，在臨床防治DN中顯示出巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。課題組將中醫(yī)學(xué)的病因病機理論，尤其是絡(luò)病理論，與多年的臨床實踐經(jīng)驗相結(jié)合，總結(jié)DN的基本病機為氣陰兩虛、血瘀阻絡(luò)，選用黃芪、地黃、黃精、丹參、川芎、水蛭、地龍、全蝎等配伍組成益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方，臨床和早期實驗表明該方治療DN效果確切。本研究以高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐

3、菌素(STZ)腹腔注射復(fù)制DN大鼠模型，以益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方對其干預(yù)，試圖以足細胞為切入點，進一步驗證該方的療效，探討該方對DN的作用機制，并比較該方與益氣養(yǎng)陰活血方和益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方的作用差別，探討該方的組方配伍機制，以效測證，探討DN的中醫(yī)證候，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　1益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方對DN大鼠的腎保護作用
　　健康雄性4～5周齡體重120g～150g SD大鼠55只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機選取10只

4、作為正常對照組(normal control group，NG)，其余大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)。12周后高脂飼料飼養(yǎng)大鼠按30mg/kg腹腔注射STZ，NG注射相應(yīng)體積枸櫞酸緩沖液。72h后空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)≥16.7 mmol/L為DM造模成功。成模大鼠按體重隨機分為模型組(model group，MG)、益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方治療組(yiqi-yangyin-huoxue-tong-luo rec

5、ipe ttreated group，YHTG)、益氣養(yǎng)陰活血方治療組(yiqi-yangyin-huo-xue recipe treated group，YHG)、益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方治療組(yiqi-yangyin-tong-luo recipe treated group，YTG)各10只，YHTG給予益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方由(黃芪、地黃、丹參、川芎各2袋，黃精、地龍、水蛭、全蝎各1袋中藥配方顆粒組成)1.00g/kg(相當(dāng)于生藥5.51g

6、/kg)、YHG給予益氣養(yǎng)陰活血方(由黃芪、地黃、丹參、川芎各2袋，黃精1袋中藥配方顆粒組成)0.92g/kg(相當(dāng)于生藥4.65g/kg)、YTG給予益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方(由黃芪、地黃各2袋，黃精、地龍、水蛭、全蝎各1袋中藥配方顆粒組成)0.79g/kg(相當(dāng)于生藥3.87g/kg)，給藥量按大鼠與人體型系數(shù)折算。NG及MG給予相應(yīng)的涼開水，日1次灌胃，共32周。于給藥第2周末(2W)、4W、8W、16W、32W代謝籠收集24小時尿液，測量

7、大鼠的飲水量、飼料消耗量、尿量、體重，記錄24h尿量，以3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清，-20℃保存。32W同時留取隨機尿標本。ELISA法檢測尿白蛋白濃度，尾靜脈取血測FBG和糖化血紅蛋白(HbAlc)后，水合氯醛麻醉大鼠，股動脈取血，分離血清，檢測血肌酐(Scr)、尿肌酐、血脂三項(總膽固醇 Tc、甘油三酯 TG、高密度脂蛋白膽固醇 HDL)，稱量腎臟重量。計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)、尿白蛋白排泄率(ACR)、腎臟指數(shù)(KI)

8、、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)。留取腎皮質(zhì)標本，行光鏡和透射電鏡檢查，依據(jù)光鏡切片測得的腎小球面積計算腎小球體積，從透射電鏡圖片上測量腎小球基底膜厚度。
　　2益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方對DN大鼠nephrin的影響
　　ELISA法檢測2w、8W、16W、32w24h尿白蛋白(U-alb)、24h尿nephrin(U-nephrin)和32W腎組織勻漿nephrin水平(K-nephrin)，分析U-alb和U-nephrin的相

9、關(guān)性，以及32W U-alb、U-nephrin和K-nephrin的相關(guān)性，反轉(zhuǎn)錄酶多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測腎皮質(zhì)nephrin mRNA的表達。
　　3益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方對DN大鼠α-輔肌動蛋白-4(α-actinin-4)和足細胞密度的影響
　　Western-blot和免疫組織化學(xué)法檢測腎皮質(zhì)α-actinin-4蛋白的表達，免疫組織化學(xué)法采用WT1 C-末端標記足細胞核，計數(shù)單個腎小球內(nèi)足細胞核數(shù)目，測量相

10、應(yīng)腎小球面積，計算足細胞密度，分析24h尿蛋白(U-pro)、α-actinin-4表達、足細胞密度之間的相關(guān)性。
　　4統(tǒng)計學(xué)方法
　　所有資料以χ-±S表示，重復(fù)測量指標采用重復(fù)測量設(shè)計資料的單變量方差分析進行比較，各觀察點進行組間兩兩比較；兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用One-Way ANOVA進行分析，兩兩組間比較采用LSD進行分析；變量間的相關(guān)性采用線性回歸分析。所有數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS16.0進行，以P<0

11、.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方對DN大鼠的腎保護作用
　　1.1各組大鼠不同觀察點FBG的比較
　　與NG比較，MG和各治療組FBG顯著升高(P<0.05)；與MG比較，YHTG16W開始FBG升高顯著改善(P<0.05)，YHG32W時FBG升高顯著改善(P<0.05)，YTG FBG升高改善不明顯(P>0.05)；治療組間比較，各觀察點FBG無顯著性差異(P>0.05)。

12、　　1.2各組大鼠不同觀察點飲水量的比較
　　與NG比較，MG和各治療組飲水量顯著增加(P<0.05)；與MG比較，YHTG2W開始飲水量增加顯著改善(P<0.05)，YHG除4W、8W外其余觀察點飲水量增加顯著改善(P<0.05)，YTG從16W開始，飲水量增加顯著改善(P<0.05)；治療組間比較，各觀察點飲水量無顯著性差異(P>0.05)。
　　1.3各組大鼠不同觀察點飼料消耗量的比較
　　與NG比較，MG和各治

13、療組飼料消耗量顯著增加(P<0.05)；與MG比較，YHTG16W始飼料消耗量增加顯著改善，YHG和YTG32W時飼料消耗量增加顯著改善(P<0.05)；治療組間比較，各觀察點飼料消耗量無顯著性差異(P>0.05)。
　　1.4各組大鼠不同觀察點尿量的比較
　　與NG比較，MG和各治療組尿量顯著增加(P<0.05)；與MG比較，各治療組尿量增加2W開始顯著改善(P<0.05)；治療組間比較，從8W開始，YHTG尿量顯著少于Y

14、HG和YTG(P<0.05)。
　　1.5各組大鼠不同觀察點體重的比較
　　造模前，高脂飼料組大鼠體重顯著高于NG(P<0.05)；造模后，NG體重呈逐漸增加趨勢，MG和各治療組體重則逐漸下降；YHTG8W始，YHG和YTG32W時體重顯著高于MG(P<0.05)；治療組間比較，各觀察點大鼠體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。
　　1.632W各組大鼠HbAlc、KI、Ccr、Scr、ACR的比較
　　與NG相比，

15、MG HbAlc、KI、Ccr、Scr、ACR顯著升高(P<0.05)，各治療組除Scr、YHG HbAlc、YTG KI外，其余指標也顯著升高(P<0.05)；與MG相比，除YTG HbAlc下降不顯著(P>0.05)外，各治療組HbAlc、Ccr、Scr、ACR顯著下降(P<0.05)，KI下降不明顯(P>0.05)；治療組間比較，YHTG對Ccr和ACR的影響大于YHG和YTG(P<0.05)，對HbAlc、KI和Scr的影響，治

16、療組間比較，差異不顯著(P>0.05)。
　　1.7各組大鼠血脂四項(Tc，TG HDL，LDL)的比較
　　與NG比較，MG血脂四項顯著升高(P<0.05)，各治療組除TG升高不明顯(P>0.05)外，TC、HDL、LDL也顯著升高(P<0.05)；與MG比較，各治療組血脂四項升高顯著改善(P<0.05)；治療組間比較，血脂四項無顯著差異(P>0.05)。
　　1.8各組大鼠腎小球體積的比較
　　與NG比較，M

17、G和各治療組腎小球體積顯著增大(P<0.05)；與MG比較，各治療組腎小球體積增大顯著減輕(P<0.05)；治療組間比較，腎小球體積無顯著差異(P>0.05)。
　　1.9各組大鼠腎小球基底膜厚度的比較
　　與NG比較，MG和各治療組腎小球基底膜厚度顯著增厚(P<0.05)；與MG比較，各治療組腎小球基底膜厚度增厚顯著減輕(P<0.05)；治療組間比較，腎小球基底膜厚度無顯著差異(P>0.05)。
　　2益氣養(yǎng)陰活血通

18、絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠nephrin的影響
　　2.1各組大鼠不同觀察點U-nephrin的比較
　　與NG比較，MG各觀察點、各治療組2W、8W U-nephrin顯著增加(P<0.05)；與MG比較，各觀察點各治療組U-nephrin增加顯著改善(P<0.05)；治療組間比較，各觀察點U-nephrin無顯著性差異(P>0.05)。
　　2.2各組大鼠不同觀察點U-alb的比較
　　與NG比較，各觀察點MG和各

19、治療組U-alb顯著增加(P<0.05)；與MG比較，YHTG從2W始、YHG和YTG從8W始，U-alb增加顯著改善(P<0.05)；治療組間比較，2W、8W時YHTG U-alb顯著低于YHG和YTG(P<0.05)。
　　2.3 MG不同觀察點U-alb和U-nephrin相關(guān)性分析
　　在各觀察點，U-alb和U-nephrin呈正相關(guān)。
　　2.4各組大鼠K-nephrin的比較
　　與NG比較，MG和

20、YHG K-nephrin顯著下降(P<0.05)，YHTG和YTGK-nephrin下降不明顯(P>0.05)；與MG比較，各治療組K-nephrin下降明顯改善(P<0.05)；治療組間比較，K-nephrin無顯著差異(P>0.05)。
　　2.5 MG大鼠32W末U-alb與U-nephrin、K-nephrin的相關(guān)性分析
　　U-alb和U-nephrin呈正相關(guān)(r=0.828，P=0.006)，U-alb和K

21、-nephrin呈負相關(guān)(r=-0.845，P=0.004)，U-nephrin和K-nephrin呈負相關(guān)(r=-0.991，P=0.000)。
　　2.6 RT-PCR檢測各組大鼠腎皮質(zhì)nephrin mRNA表達
　　與NG比較，MG和各治療組nephrin mRNA表達顯著下降(P<0.05)；與MG比較，各治療組nephrin mRNA表達下降顯著改善(P<0.05)；治療組間比較，nephrin mRNA表達無顯

22、著差異(P>0.05)。
　　3益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠α-actinin-4蛋白表達及足細胞密度的影響
　　3.1 Western-blot檢測大鼠腎皮質(zhì)α-actinin-4的表達
　　與NG比較，MG、YHG和YTG腎皮質(zhì)α-actinin-4的表達顯著下降(P<0.05)，YHTG腎皮質(zhì)α-actinin-4的表達下降不明顯(P>0.05)；與MG比較，各治療組腎皮質(zhì)α-actinin-4的表達減弱顯

23、著改善(P<0.05)；治療組間比較，YHTG大鼠腎皮質(zhì)α-actinin-4蛋白的表達明顯高于YHG和YTG(P<0.05)。
　　3.2免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腎皮質(zhì)α-actinin-4的表達
　　與NG比較，MG、YHG和YTG腎皮質(zhì)α-actinin-4的表達顯著下降(P<0.05)，YHTG腎皮質(zhì)α-actinin-4的表達下降不明顯(P>0.05)；與MG比較，各治療組腎皮質(zhì)α-actinin-4的表達減弱顯著改

24、善(P<0.05)；治療組間比較，YHTG大鼠腎皮質(zhì)α-actinin-4蛋白的表達明顯高于YHG和YTG(P<0.05)。
　　3.3各組大鼠足細胞密度的比較
　　與NG比較，MG和各治療組足細胞密度顯著減小(P<0.05)；與MG比較，各治療組足細胞密度減小顯著改善(P<0.05)；治療組間比較，足細胞密度無顯著差異(P>0.05)。
　　3.4各組大鼠U-pro的比較
　　與NG比較，MG和各治療組U-pr

25、o顯著增加(P<0.05)；與MG比較，各治療組U-pro增加顯著改善(P<0.05)；治療組間比較，YHTG U-pro顯著低于YHG和YTG(P<0.05)。
　　3.5 MG大鼠U-pro、腎皮質(zhì)α-actinin-4/β-actin、足細胞密度的相關(guān)性分析
　　U-pro和α-actinin-4/β-actin呈負相關(guān)(r=-0.846，P=0.004)；U-pro和足細胞密度呈負相關(guān)(r=-0.844，P=0.00

26、2)；足細胞密度和α-actinin-4/β-actin呈正相關(guān)(r=0.815，P=0.007)。
　　結(jié)論：
　　1益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方、益氣養(yǎng)陰活血方和益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方能顯著減輕DN大鼠“三多一少”表現(xiàn)，改善DN大鼠脂代謝紊亂，降低DN大鼠ACR、U-pro和腎小球高濾過，減輕腎小球肥大和腎小球基底膜增厚，具有腎保護作用；
　　2益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方、益氣養(yǎng)陰活血方可顯著改善DN大鼠糖代謝紊亂，益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方對糖代謝紊

27、亂改善不顯著；益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方、益氣養(yǎng)陰活血方、益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方可減少DN大鼠尿nephrin的排出、抑制腎皮質(zhì)nephrin蛋白和基因表達的下調(diào)、改善α-actinin-4蛋白的下調(diào)、減輕足細胞密度的下降，對DN足細胞有保護作用；
　　3益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)方在降低ACR、減少U-pro、減少尿量、改善腎小球高濾過等方面明顯優(yōu)于益氣養(yǎng)陰活血方和益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方，可能與其改善α-actinin-4蛋白的下調(diào)優(yōu)于益氣養(yǎng)陰活血方和益氣養(yǎng)陰通