蘆丁對UUO大鼠腎間質纖維化的影響及作用機制的研究.pdf

1、目的:通過觀察蘆丁對單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstructive，UUO)大鼠腎間質纖維化模型的腎臟組織病理及相關纖維化因子表達的影響，進而探討蘆丁對腎間質纖維化的保護作用及作用機制。
　　方法:1.UUO大鼠模型的建立及分組
　　SPF級成年雄性Wiatar大鼠，體重200-250g，共24只，隨機均分成4組:假手術組（Sham+Vehicle），假手術組+蘆丁治療組(Sham+Rutin

2、)，模型組(UUO+Vechicle)，蘆丁治療組（UUO+Rutin）。適應性飼養(yǎng)1周后，對模型組和蘆丁治療組大鼠行左側輸尿管結扎建立UUO模型，假手術組大鼠僅游離左側輸尿管，不予結扎，其余麻醉及手術步驟一致。Sham+Rutin和UUO+Rutin兩組大鼠分別給予蘆丁100mg/(kg·d)溶于1％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液中灌胃;Sham+Vechicle和UUO+Vechicle兩組大鼠給予等量1％CMC-Na溶液。全部

3、大鼠于術后2周處死，一部分腎組織用4％多聚甲醛固定保存用于組織學檢測，其余腎組織用液氮速凍后保存于-80℃冰箱用于蛋白提取。
　　2.組織病理學觀察
　　組織標本4％多聚甲醛固定、石蠟包埋后，取4μm切片脫蠟至水，按常規(guī)方法分別行HE和Masson染色。取HE、Masson染色切片，每例切片在高倍鏡下(200×)隨機觀察10個互不重疊腎小管間質視野并拍照，分析腎臟間質損傷及纖維化程度。
　　3.免疫組織化學染色

4、　　采用二步法免疫組化檢測系統(tǒng)。腎臟組織切片常規(guī)脫蠟水化，在檸檬酸鹽緩沖液中微波熱修復20min。依次予3％過氧化氫溶液孵育15min消除內源性過氧化物酶，一抗4℃孵育過夜，試劑一37℃孵育20min，試劑二37℃孵育20-30min。PBS洗后用DAB顯色液顯色，中性樹膠封片后每張切片在顯微鏡下(200×)隨機觀察10個互不重疊視野并拍照，最后采用Image Pro Plus圖像分析軟件進行半定量分析。
　　4.Western

5、Blot
　　腎臟組織經勻漿、裂解、離心(12000rpm，4℃，15min)后，采用BCA法測定總蛋白濃度。吸取等量蛋白樣品(50ug)，經過10％ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉至PVDF膜上，再依次經封閉、一抗4℃孵育過夜、二抗室溫孵育1h以及化學發(fā)光顯影，最后采用Image J軟件對各條帶進行半定量分析。
　　5.統(tǒng)計學分析方法
　　統(tǒng)計學分析應用SPSS19.0軟件。全部計量資料數(shù)據表示為均數(shù)±標準差（(

6、x)±s）。組間比較選用t檢驗或單因素方差分析(One-Way ANOVA)，多重比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1.組織病理學檢查結果:
　　HE染色結果顯示，假手術組和假手術+蘆丁治療組大鼠腎臟組織學正常。模型組大鼠可見嚴重腎間質損傷，包括腎小管擴張、萎縮以及小管上皮細胞空泡變性，腎間質纖維化，腎間質大量炎癥細胞浸潤。腎間質損傷評分顯示:與假手術比較，模型組腎間質損傷明顯增加(P＜

7、0.001);與模型組比較，蘆丁治療組大鼠腎臟腎間質損傷明顯減輕(P＜0.05)。
　　腎間質纖維化程度采用Masson染色觀察。與假手術組比較，模型組大鼠腎間質可間明顯膠原沉積，而且腎間質纖維化面積顯著增高(P＜0.001)。蘆丁治療組大鼠腎間質膠原沉積明顯減少，腎間質纖維化面積百分比分析顯著降低(P＜0.05)。
　　2.免疫組化染色結果
　　染色圖片及半定量分析結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腎臟Collge

8、nⅠ/Ⅲ、Fibronectin、α-SMA和CD68蛋白表達明顯增加(P＜0.001)，而E-cadherin蛋白表達明顯減少(P＜0.001);與模型組比較，蘆丁治療組腎大鼠腎臟間質中ColgenⅠ/Ⅲ、Fibronectin、α-SMA和CD68蛋白表達表達明顯減少(P＜0.05)，而E-cadherin蛋白表達相對增加(P＜0.05)。
　　3.Western Blot結果
　　Western blot免疫印記條帶及

9、半定量分析結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腎臟CollgenⅠ/Ⅲ、Fibronectin、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3、CD68、TNF-α、IL-1β和p-NFκB蛋白表達均明顯增加(P＜0.001)，而E-cadherin蛋白表達明顯減少(P＜0.05);與模型組比較，蘆丁治療組大鼠腎臟CollgenⅠ/Ⅲ、Fibronectin、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3、CD68、TNF-α、IL-1β和p-NF