RNA干擾沉默CRBP-1基因表達(dá)抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為以下三部分： 第一部分：大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 目的：構(gòu)建和鑒定大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒載體。 方法：針對(duì)篩選確定的大鼠CRBP-1基因RNA干擾(RNAi)有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)HpaI和XhoI酶切后的pGCL-GFP載體連接產(chǎn)生shRNA慢病毒載體，命名為L(zhǎng)v-shCRBP-1，PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定。再將

2、Lv-shCRBP-1轉(zhuǎn)染大鼠原代HSCs，采用RealtimePCR的方法檢測(cè)CRBP-1的mRNA表達(dá)。 結(jié)果：PCR鑒定與DNA測(cè)序證實(shí)合成的Lv-shCRBP-1寡核苷酸鏈插入正確。Lv-shCRBP-1在大鼠HSCs上對(duì)CRBP-1基因有顯著的敲減作用。 結(jié)論：成功構(gòu)建大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒載體。 第二部分：慢病毒介導(dǎo)的CRBP-1基因RNAi對(duì)大鼠HSC生物學(xué)特性的影響 目的：研

3、究慢病毒介導(dǎo)的CRBP-1基因RNAi對(duì)大鼠HSC生物學(xué)特性的影響。 方法：表達(dá)CRBP-1shRNA慢病毒載Lv-shCRBP-1在體外轉(zhuǎn)染HSCs，應(yīng)用RealtimePCR檢測(cè)CRBP-1、α-SMA、Collagen-1、MMP3、TIMP1/2等基因的表達(dá)情況，Westernblot技術(shù)檢測(cè)α-SMA、Collagen-1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1)Lv-shCRBP-1在轉(zhuǎn)染HSCs后CRBP-1、α-SMA、C

4、ollagen-1mRNA的表達(dá)下調(diào)，MMP13、TIMP1/2mRNA的表達(dá)上調(diào)。2)Lv-shCRBP-1在轉(zhuǎn)染HSCs后CRBP-1和α-SMA的蛋白合成下降。 結(jié)論：Lv-shCRBP-1可以有效地抑制HSCs中CRBP-1和α-SMA的mRNA表達(dá)及蛋白合成，同時(shí)使Collagen-1mRNA的表達(dá)下調(diào)，MMPB、TIMP1/2的mRNA表達(dá)上調(diào)，使HSCs細(xì)胞外基質(zhì)分泌下降。 第三部分：慢病毒介導(dǎo)的CRBP-

5、1基因RNAi對(duì)大鼠肝纖維化發(fā)展的影響 目的：在大鼠體內(nèi)探討慢病毒介導(dǎo)的CRBP-1基因RNAi對(duì)抗肝纖維的作用。 方法：在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，在注射CCl4的前1周，經(jīng)門靜脈注射Lv-shCRBP-1轉(zhuǎn)染大鼠肝臟，CCl4注射的第4周處死大鼠，摘取肝臟，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝臟中CRBP-1、α-SMA、Collagen-1基因的表達(dá)，檢測(cè)肝臟組織中羥脯氨酸(Hyp)的含量，同時(shí)取大鼠肝臟行組織學(xué)檢查。

6、 結(jié)果：Lv-shCRBP-1轉(zhuǎn)染肝臟組織中，顯著降低CRBP-1、α-SMA、Collagen-1的表達(dá)，Hyp含量顯著下降，肝臟的組織學(xué)變化改善，表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂減輕，纖維間隔變薄，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。 結(jié)論：Lv-shCRBP-1可通過(guò)抑制肝臟組織中CRBP-1的表達(dá)，從而抑肝臟組織中Collagen-1和α-SMA等基因的表達(dá)，改善肝功能并減輕肝纖維化程度。 本實(shí)驗(yàn)成功成功構(gòu)建大鼠CRBP-1基因sh