CVB3對Hela細胞高爾基體及其細胞周期的影響.pdf

1、目的： 探討CVB3（Coxsackievirus B3）對Hela （Henrietta Lacks strain of cancer cells）細胞高爾基體及其細胞周期的影響，為研究CVB3的致病機制奠定基礎(chǔ)。 方法： 將Hela細胞株作為敏感宿主細胞進行以下實驗，用MOI（multiplicity of infection）為5的CVB3感染細胞： 1、免疫熒光雙標檢測病毒感染后0h、1.5 h、

2、3h、4.5 h和6h等時間點VP1、GM130（Golgi matrix protein 130）和GRASP65（Golgi reassembly stacking protein 65）在細胞中的定位； 2、選擇CVB3感染0h、1.5 h、3h、4.5 h、6h、7.5 h、9h、10.5 h、12 h、13.5 h、15 h、16.5 h、18 h、21h和24 h等時間點收集細胞，進行總蛋白定量后，Western B

3、lot檢測VP1、GM130和GRASP65蛋白的表達變化； 3、分別選擇G1/S期或G2/M期同步化細胞釋放0h、3h、6h和9h等時間點，流式細胞儀檢測CVB3病毒感染組與正常細胞組之間的細胞周期差異。 結(jié)果： 1、免疫熒光雙標結(jié)果顯示： （1）GM130和GRASP65的免疫熒光雙標結(jié)果顯示：GM130與GRASP65之間存在明顯共定位，正常Hela細胞高爾基體位于近核區(qū)，高爾基帶連續(xù)。 （

4、2）GM130和VP1的免疫熒光雙標結(jié)果顯示：正常細胞GM130免疫熒光呈帶狀分布，位于近核區(qū)；而自病毒感染3h后，GM130的熒光在病毒感染細胞中出現(xiàn)散點狀分布。 （3）GRASP65和VP1的免疫熒光雙標結(jié)果顯示：正常細胞GRASP65免疫熒光呈帶狀分布，位于近核區(qū)；而自病毒感染3h后，GRASP65的熒光開始出現(xiàn)較明顯的彌散分布。 2、Western blot結(jié)果顯示：GM130的表達量自病毒感染后逐漸下降，至病毒

5、感染18h后未檢測出GM130的表達；GRASP65的表達量變化趨勢與GM130基本一致，但病毒感染12h后即未檢測出其表達；VP1的蛋白表達量自病毒感染開始即持續(xù)上升，6h后一直維持在較高水平。 3、流式細胞儀檢測結(jié)果顯示： （1）對胸苷雙阻斷法同步在G1/S期的細胞，釋放0h、3h、6h和9h后，正常細胞組G1期的細胞比例分別是：89.14％、65.77％、14.14％和13.11％；而病毒感染細胞組G1期細胞比例分

6、別是：91.08％、84.41％、81.81％和81.74％。 （2）經(jīng)諾考達唑（Nocodazole）作用后，G2期的細胞比例由非同步化狀態(tài)時的4.62％上升到40％以上，表明諾考達唑已將部分細胞同步化G2/M期；同步化釋放0h、3h、6h和9h后，正常細胞組G2期細胞比例分別是：42.99％、51.93％、37.97％和21.35％；而病毒感染細胞組G2期細胞比例分別是：61.25％、43.34％、29.37％和27.62％

7、，與此同時G1期細胞比例分別是：8.48％、28.01％、28.10％和33.46％0 結(jié)論： 1、CVB3感染引起Hela細胞高爾基帶斷裂，高爾基體結(jié)構(gòu)受到影響。這可能是CVB3感染導致宿主細胞病變效應(yīng)的機制之一。 2、CVB3感染下調(diào)了GM130和GRASP65的表達。GM130和GRASP65的蛋白表達下降可能是高爾基體結(jié)構(gòu)破壞的機制之一。 3、CVB3感染G1/S期細胞后，細胞周期主要停滯在G1期