沉默高爾基體磷蛋白-3抑制胃癌細(xì)胞侵襲遷移及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：沉默高爾基體磷蛋白-3基因在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響，探討mTOR/STAT3信號(hào)通路在上述過(guò)程中的作用及機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建高爾基體磷蛋白-3基因RNA干擾慢病毒載體和慢病毒陰性對(duì)照載體，用慢病毒法轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)和蛋白

2、印跡(Western Blotting，wB)法分別檢測(cè)GOLPH3在空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染慢病毒的胃癌細(xì)胞SGC-7901)、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載載體的胃癌細(xì)胞SGC-7901）和GOLPH3-siRNA組（轉(zhuǎn)染GOLPH3-siRNA載體的胃癌細(xì)胞SGC-7901）中的基因水平和蛋白水平的表達(dá);應(yīng)用Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)GOLPH3基因沉默后胃癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化;Western blotting法檢測(cè)

3、各組細(xì)胞mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：成功建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞SGC-7901，轉(zhuǎn)染效率接近90％，在體外能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白;GOLPH3-siRNA組GOLPH3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而陰性對(duì)照組GOLPH3mRNA相對(duì)表達(dá)量和空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05

4、）;空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、GOLPH3-siRNA組中GOLPH3蛋白表達(dá)量分別為:0.91±0.09，0.90±0.04，0.38±0.05，GOLPH3-siRNA組中GOLPH3蛋白表達(dá)量較兩對(duì)照組明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組GOLPH3蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(P＞0.05); Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示GOLPH3-siRNA組胃癌細(xì)胞穿越Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)(70.3

5、±8.5)，明顯低于陰性對(duì)照組(171.67±3.2)和空白對(duì)照組(167.6±11.0)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）;Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)顯示GOLPH3-siRNA組胃癌細(xì)胞通過(guò)聚碳酸酯微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)(82.0±3.6)，明顯低于陰性對(duì)照組(177.0±5.29)和空白對(duì)照組(174.3±4.7)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）; Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，GOLPH3-siRNA組細(xì)胞中