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文檔簡介
1、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(Spinocerebellar Ataxia Type3/SCA3)又稱馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease/MJD),是常染色體顯性遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)最常見亞型,在中國的患病率約為3~5/10萬。該病是由位于14q32.1上的ATXN3基因CAG三核苷酸異常重復(fù)擴(kuò)增引起的疾病,是目前已發(fā)現(xiàn)的9種由CAG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增引起疾病中的一種。該病的主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的小腦性共濟(jì)失調(diào)、
2、步態(tài)不穩(wěn)、動作笨拙,可伴有眼球震顫,吞咽障礙以及感覺異常等,當(dāng)前尚無有效的治療方法。
SCA3的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,既往的研究表明包涵體形成、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)功能的異常、神經(jīng)元軸突運(yùn)輸障礙、細(xì)胞氧化應(yīng)激功能障礙、細(xì)胞自噬和凋亡的障礙、線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常等均可能參與了SCA3的發(fā)病。
高爾基體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,主要參與對部分脂質(zhì)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白質(zhì)的加工、修飾、分類、包裝與運(yùn)輸,高爾基體在細(xì)胞尤其是
3、神經(jīng)細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。研究表明高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的異常參與了肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、帕金森病(PD)、阿爾茲海默病(AD)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)2型(SCA2)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程,高爾基體碎裂可能是細(xì)胞凋亡的不可逆病理表現(xiàn)。當(dāng)前,在SCA3發(fā)病過程中,細(xì)胞高爾基體形態(tài)的變化以及高爾基體是否參與SCA3的發(fā)病過程鮮有報道。
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)是一類與胚胎干細(xì)胞具有類似形態(tài)和生物學(xué)功能的細(xì)胞,是由日本科
4、學(xué)家山中彌伸于2006年通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞重編程建立。與胚胎干細(xì)胞類似,誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可在體外進(jìn)一步分化為各類組織細(xì)胞,患者來源的iPSCs可為研究疾病的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選、基因編輯和細(xì)胞移植治療提供理想的細(xì)胞模型。
本研究通過檢測SCA3患者來源的皮膚成纖維細(xì)胞中ataxin-3蛋白、高爾基體蛋白GM130的表達(dá)情況,初步探討了SCA3患者來源皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體的形態(tài)的變化,并成功的構(gòu)建了患者皮膚成纖維細(xì)胞來源的誘
5、導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs),為后續(xù)分化獲得患者來源的神經(jīng)細(xì)胞用于進(jìn)一步探討該病的發(fā)病機(jī)制和藥物篩選等奠定了基礎(chǔ)。
目的:
檢測SCA3患者皮膚成纖維細(xì)胞中高爾基體形態(tài)的變化,構(gòu)建患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)。
方法:
1.采用機(jī)械分離法培養(yǎng)SCA3患者與健康志愿者的皮膚成纖維細(xì)胞;
2.CCK8細(xì)胞活力檢測試劑盒檢測皮膚成纖維細(xì)胞活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平,分別采用配對t
6、檢驗和兩獨立樣本t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;
3.免疫熒光法標(biāo)記皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體蛋白GM130,觀察高爾基體形態(tài),計數(shù)高爾基體碎裂的細(xì)胞數(shù),x2檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;
4.Western-blot檢測皮膚成纖維細(xì)胞ataxin-3,GM130的蛋白表達(dá),采用t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;
5.透射電鏡驗證皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體形態(tài)的改變;
6.采用仙臺病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs);
7、r> 7.堿性磷酸酶染色、核型分析、免疫熒光、流式細(xì)胞、畸胎瘤形成等鑒定患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs);
8.毛細(xì)管電泳法檢測患者來源的iPSCs中ATXN3基因的表達(dá)情況。
結(jié)果:
1.通過機(jī)械分離法法成功的建立了SCA3患者與健康志愿者皮膚成纖維細(xì)胞;
2.患者來源的皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)突變的ataxin-3蛋白,與健康志愿者皮膚成纖維細(xì)胞相比活力降低(t=2.889,p=0.045)
8、,凋亡增加(t=-5.159,p=0.007),高爾基體碎裂增多(x2=16.61,p<0.01),GM130表達(dá)量降低(t=43.658,p<0.01);
3.SCA3患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)堿性磷酸酶染色陽性,具有正常的二倍體核型,高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4、Nanog和TRA-1-60,在NOD-SCID小鼠體內(nèi)能成功的分化為具有三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤;
4.患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)攜帶
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