CAR和DAF在CVB3感染HeLa細(xì)胞中的上調(diào)變化規(guī)律.pdf

1、目的： 柯薩奇病毒（Coxsachievirus，CV）是一類在自然界普遍存在的病毒，屬于小核糖核酸病毒科（Picornaviridas），腸道病毒屬（Enterovirus）。柯薩奇病毒已知有30個(gè)血清型，根據(jù)病毒對(duì)乳鼠的致病特點(diǎn)及對(duì)細(xì)胞敏感性的不同，將病毒分成A組和B組，B組病毒有6個(gè)血清型B1－B6，可引起特征性傳染性胸肋痛，合并腦膜腦炎、心肌炎、肝炎、溶血性貧血等。其中柯薩奇病毒B3型（CVB3）侵入機(jī)體之后，主要導(dǎo)致病

2、毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）、腦膜炎等。從CVB3的感染動(dòng)力學(xué)可得知，CVB3感染的細(xì)胞譜十分廣泛，其感染性及程度的主要因素之一取決于這些細(xì)胞表面柯薩奇病毒受體與病毒的相互作用；通過(guò)分析柯薩奇病毒易感細(xì)胞與非感染細(xì)胞的差異，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了柯薩奇病毒－腺病毒受體（CAR）、衰變加速因子（DAF）等受體。CAR幾乎表達(dá)在所有體細(xì)胞的表面，可能與細(xì)胞的粘接和增殖有關(guān)，但確切的生物學(xué)功能至今還不清楚，近期發(fā)現(xiàn)CAR可作為

3、柯薩奇病毒和腺病毒的共同病毒受體，才受到研究者的廣泛關(guān)注。DAF也廣泛表達(dá)于體內(nèi)的多種細(xì)胞，早期發(fā)現(xiàn)DAF可作為一種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，其調(diào)節(jié)補(bǔ)體的功能現(xiàn)已明確，但它作為一種病毒受體的功能卻研究甚少。目前，CVB3具體的致病機(jī)制還不清楚，CVB3結(jié)合受體時(shí)，動(dòng)態(tài)構(gòu)象中結(jié)合位點(diǎn)的定位、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架的變化等均值得深入研究。 在本實(shí)驗(yàn)中，用CAR抗體和DAF抗體干預(yù)HeLa細(xì)胞，檢測(cè)在CVB3感染時(shí)CAR抗體和DAF抗體對(duì)細(xì)胞的保

4、護(hù)作用，間接反映出CAR和DAF在CVB3入侵HeLa細(xì)胞過(guò)程中所起作用的大小；并分別在RNA水平和蛋白水平上檢測(cè)CAR和DAF隨病毒感染時(shí)間和濃度的變化規(guī)律。 方法： 1、不同濃度的CAR抗體和DAF抗體對(duì)HeLa細(xì)胞的保護(hù)作用： 實(shí)驗(yàn)分為5組：①V（virus）組：即病毒組，加入CVB3與HeLa細(xì)胞相互作用，作為陽(yáng)性對(duì)照；②D（DAF抗體）組：即DAF抗體作用組，在加入CVB3之前，先用DAF抗體與HeLa

5、細(xì)胞相互作用。③C（CAR抗體）組：即CAR抗體作用組，在加入CVB3之前，先用CAR抗體與HeLa細(xì)胞相互作用。④C+D（CAR抗體和DAF抗體）組：即CAR抗體和DAF抗體共同作用組，在加入CVB3之前，先用CAR抗體和DAF抗體共同與HeLa細(xì)胞相互作用。⑤NOR（normal）組：即正常HeLa細(xì)胞對(duì)照組，用正常的HeLa細(xì)胞做為以上各組的陰性對(duì)照。 （1）MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性：在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組細(xì)胞光密度值

6、（OD值），計(jì)算出各組均值、細(xì)胞相對(duì)生存率（RSR）及各組抗體對(duì)病毒的抑制率（IR）。 （2）空斑計(jì)數(shù)法檢測(cè)抗體對(duì)病毒毒力的影響：對(duì)各組的病毒空斑用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，并計(jì)算出各組的空斑形成單位。 2、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT—PCR）檢測(cè)CARmRNA、DAFmRNA在CVB3入侵HeLa細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)變化：用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并拍照、掃描

7、。將凝膠電泳圖條帶密度進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，計(jì)算電泳條帶與β—actin擴(kuò)增條帶光密度值作為其相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAR和DAF在病毒入侵HeLa細(xì)胞過(guò)程中表達(dá)的變化：CVB3與HeLa細(xì)胞相互作用后，加入CAR和DAF的熒光抗體，用流式細(xì)胞儀對(duì)二者的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果： 1、MTT法檢測(cè)結(jié)果：細(xì)胞生存率與抗體濃度呈正相關(guān)，在細(xì)胞的生存率方面，D組與V組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組與V組相比差異有統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義（P<0.05），C+D組與V組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在對(duì)病毒的抑制率上，C+D組對(duì)病毒的抑制效果最好，且在抑制效果上C組+D組

9、顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。1h之后，DAF的表達(dá)恢復(fù)正常，CAR仍維持在較高水平。并且CAR和DAF的上調(diào)幅度與CVB3的濃度成正相關(guān)。 結(jié)論： 在CVB3侵入HeLa細(xì)胞過(guò)程中，作為病毒受體的CAR與DAF相比起到更為主要的作用，且CAR和DAF可能具有一定的協(xié)同作用。CVB3的侵入會(huì)上調(diào)DAF和CAR在細(xì)胞表面的表達(dá)，且上調(diào)程度與CVB3的濃度呈正相關(guān)。CVB3在侵入細(xì)胞后，細(xì)胞表面DAF的表達(dá)迅速下調(diào)，這可能