與CVB3 3A相互作用的人心臟蛋白的篩選及功能初探.pdf

1、目的：
　　運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，從人心臟 cDNA文庫(kù)中篩選與 CVB3非結(jié)構(gòu)蛋白3A相互作用的人細(xì)胞蛋白；選取陽(yáng)性蛋白之一的TMED4進(jìn)行研究，探討CVB33A與TMED4的相互作用及其生物學(xué)意義，為進(jìn)一步研究CVB3的致病機(jī)制及治療CVB3引起的相關(guān)疾病提供新的方向和依據(jù)。
　　方法：
　　1.以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再經(jīng)PCR擴(kuò)增出3A基因，并將其重組至真核表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7中，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pG

2、BKT7-3A；
　　2.采用乙酸鋰法將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-3A轉(zhuǎn)化至酵母菌AH109中；
　　3.Western Blot檢測(cè)融合蛋白DNA-BD-c-Myc-3A在酵母菌AH109[pGBKT7-3A]中的表達(dá)；
　　4. SD/–Ade/–Trp和SD/–His/–Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基及X-α-Gal實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3A對(duì)報(bào)告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的轉(zhuǎn)錄自激活作用，小規(guī)模配合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)酵母菌的配合功能；

3、r>　　5.大規(guī)模配合篩選與3A蛋白相互作用的人細(xì)胞蛋白；
　　6.采用表型鑒定、PCR擴(kuò)增和Alu I酶切等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)篩選所得陽(yáng)性候選克隆進(jìn)行歸類(lèi)、測(cè)序及同源性比對(duì)分析；
　　7. SD/–Ade/–Leu和SD/–His/–Leu營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基的鑒定方法及X-α-Gal實(shí)驗(yàn)檢測(cè)篩選所得陽(yáng)性質(zhì)粒 pGADT7-ADx對(duì)報(bào)告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的轉(zhuǎn)錄自激活作用，利用回返配合實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證3A蛋白與各陽(yáng)性蛋白的相

4、互作用；
　　8.質(zhì)粒pBudCE4.1-3A轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞36 h后，采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，用Alexa Flour488山羊抗兔二抗（綠色熒光）與兔抗TMED4的特異性結(jié)合來(lái)標(biāo)記 TMED4在細(xì)胞內(nèi)的定位，用Rhodamine山羊抗鼠二抗（紅色熒光）與鼠抗His-Tag的特異性結(jié)合來(lái)標(biāo)記3A在細(xì)胞中的定位，利用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)觀察3A蛋白與TMED4在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照；
　　9.質(zhì)

5、粒pBudCE4.1-3A轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞蛋白裂解液，分別采用anti-TMED4或 anti-His-Tag進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)免疫共沉淀，進(jìn)一步驗(yàn)證3A蛋白與陽(yáng)性蛋白TMED4之間的相互作用；
　　10.收集質(zhì)粒pBudCE4.1-3A和pBudCE4.1轉(zhuǎn)染后24 h、36 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，加入 CCK-8溶液后酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處各樣品 OD值，采用SPSS13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析；
　

6、　11.收集質(zhì)粒pBudCE4.1-3A和pBudCE4.1轉(zhuǎn)染后24 h、36 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，使用Annexin V試劑盒對(duì)早期凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色后，高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)對(duì)早期凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析；
　　12.質(zhì)粒pBudCE4.1-3A對(duì)細(xì)胞周期的影響：以G1/S期為切入點(diǎn)，收集質(zhì)粒pBudCE4.1-3A和pBudCE4.1轉(zhuǎn)染后24 h、36 h、48 h、54 h各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變

7、化；
　　13.用質(zhì)粒pBudCE4.1-3A轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞18 h、24 h、36 h、40 h、48 h、54 h、60 h，采用MOI=5的CVB3感染HeLa細(xì)胞3h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h，收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞蛋白裂解液，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞為對(duì)照，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TMED4的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.雙酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果提示3A已成功重組至 pGBK

8、T7載體的多克隆位點(diǎn)，且閱讀框與病毒3A基因一致；
　　2.表型鑒定和PCR法驗(yàn)證重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-3A已成功轉(zhuǎn)入酵母菌AH109中；
　　3.3A能在酵母菌AH109[pGBKT7-3A]中表達(dá)并且對(duì)酵母菌無(wú)毒性作用；
　　4. SD/–Ade/–Trp和SD/–His/–Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基和酶底物X-α-Gal顏色的變化情況顯示3A對(duì)報(bào)告基因無(wú)轉(zhuǎn)錄自激活作用，小規(guī)模配合實(shí)驗(yàn)表明3A蛋白在AH109中的表達(dá)

9、不影響酵母菌的配合功能；
　　5.以CVB33A為誘餌，經(jīng)大規(guī)模配合實(shí)驗(yàn)，從人心臟cDNA文庫(kù)中篩選得到52個(gè)陽(yáng)性候選克隆；
　　6.五十二個(gè)陽(yáng)性候選克隆經(jīng)Alu I酶切分析后可歸為6類(lèi)，通過(guò)測(cè)序和同源性比對(duì)，共獲得6種不同類(lèi)別的陽(yáng)性蛋白：蘭尼堿受體2（Ryanodine Receptor2,RyR2），信號(hào)肽酶2（Signal peptidase complex subunit2,SPCS2），跨膜蛋白emp24（Tran

10、smembrane emp24 protein transport domain containing4,TMED4），細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（Cytochrome c oxidase subunit I,COX1），細(xì)胞色素c氧化酶亞基III（Cytochrome c oxidase subunit III,COX3）和肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain,MYH7）/琥珀酸脫氫酶亞基D（Succinate dehydr

11、ogenase complex subunit D,SDHD）；
　　7. SD/–Ade/–Leu和SD/–His/–Leu營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基和酶底物X-α-Gal顏色的變化情況顯示6種陽(yáng)性蛋白對(duì)報(bào)告基因無(wú)轉(zhuǎn)錄自激活作用，回返配合實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證6種陽(yáng)性蛋白與3A蛋白存在相互作用；
　　8.高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)顯示宿主蛋白TMED4主要在胞漿中表達(dá)，而病毒蛋白3A主要表達(dá)在胞漿核周區(qū)域，提示3A與TMED4在細(xì)胞胞漿內(nèi)存在共定位

12、現(xiàn)象；
　　9.在質(zhì)粒pBudCE4.1-3A轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中，3A蛋白能夠被anti-TMED4抗體共沉淀，而 TMED4也能夠被 anti-His-tag抗體共沉淀。細(xì)胞內(nèi)免疫共沉淀結(jié)果提示：在質(zhì)粒 pBudCE4.1-3A轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)，3A與 TMED4能夠發(fā)生相互作用；
　　10. CCK-8法結(jié)果提示：質(zhì)粒pBudCE4.1-3A轉(zhuǎn)染細(xì)胞后36 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比明顯下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而轉(zhuǎn)

13、染24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比無(wú)明顯差異；
　　11.高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)觀察早期凋亡細(xì)胞：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后36 h，3A轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞數(shù)較空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組有明顯增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而轉(zhuǎn)染24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞并無(wú)明顯差異；
　　12.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染3A的細(xì)胞組 G1期細(xì)胞比例一直高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組，54 h細(xì)胞組G1期細(xì)胞比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而S期、G

14、2期的細(xì)胞比例沒(méi)有明顯變化。
　　13.收集質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和活病毒感染各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞蛋白裂解液，Western Blot檢測(cè)結(jié)果：3A轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的TMED4表達(dá)量逐漸下降，于轉(zhuǎn)染36 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最低，隨后開(kāi)始回升，至60 h后維持穩(wěn)定；空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)TMED4表達(dá)量未發(fā)現(xiàn)明顯改變；CVB3活病毒感染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi) TMED4的表達(dá)逐漸下降，于感染9 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最低，隨后開(kāi)始回升，正常細(xì)胞對(duì)照組TMED4表達(dá)量無(wú)明顯改變。