金屬硫蛋白-3（MT-3）相互作用蛋白的分子克隆、鑒定及性質(zhì)研究——探索金屬硫蛋白-3及其相互作用蛋白功能的分子機(jī)制.pdf

1、Alzheimer's病最顯著的神經(jīng)病理特征是神經(jīng)突形成以淀粉樣蛋白為核心的老年斑,由雙股螺旋微絲構(gòu)成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及大量的神經(jīng)元喪失,盡管目前還無法確定AD的病因,許多證據(jù)已經(jīng)表明,MT-3(又叫神經(jīng)生長抑制因子,GIF)含量下降是造成AD腦大量神經(jīng)元喪失的主要因素.MT-3主要分布于腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng),在Alzheimer's癥腦提取物的存在下,對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞具有特異的生長抑制活性.值得注意的是,單獨(dú)的MT-3或單獨(dú)的腦提取物

2、均不具有生長抑制活性,這表明,MT-3可能是與腦提取物中的其它因子協(xié)同作用而發(fā)揮其抑制功能的.迄今,對(duì)于MT-3對(duì)AD的作用機(jī)理,首次利用酵母雙雜交系統(tǒng)(又稱相互作用陷阱)在正常人腦cDNA文庫中對(duì)GIF相互作用蛋白進(jìn)行了快速篩選,并通過GST融合表達(dá)系統(tǒng)對(duì)篩選到的GIFIP基因進(jìn)行了表達(dá),再從蛋白質(zhì)的水平上進(jìn)一步分析,確證表達(dá)產(chǎn)物與MT-3的相互作用及細(xì)胞生物學(xué)協(xié)同活性.為了進(jìn)一步證實(shí)dUTPase與MT-3相互作用的真實(shí)性和特異性,

3、通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證它們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞293中的相互作用.將MT-3克隆于帶Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pFlag-CMV-2,獲得能表達(dá)Flag-MT-3的真核表達(dá)質(zhì)粒MT-3/pFlag-CMV-2.將細(xì)胞核dUTPase cDNA克隆于帶HA標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pSV-HA中,獲得表達(dá)HA-dUTPase融合蛋白的真核重組表達(dá)質(zhì)料dUTPase/pSV-HA.使用Lipofectamine將MT-3/pFlag-CMV-2和dUT

4、Pase/pSV-HA共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,并以MT-1/pFlag-CMV-2和dUTPase/pSV-HA共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞為對(duì)照,結(jié)果表明dUTPase可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)與MT-1不發(fā)生相互作用,可與MT-3特異性結(jié)合.為了將來研究MT-3及其相互作用蛋白性質(zhì)和功能的需要,鑒于蛋白單抗制備的困難,以大耳家兔為免疫動(dòng)物,對(duì)MT-3及其相互作用蛋白的多抗進(jìn)行了制備,進(jìn)一步利用硫酸鹽沉淀法分離純化多抗IgG,通過一定的測(cè)定方法和相關(guān)研究實(shí)