日本囊對蝦金屬硫蛋白基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、日本囊對蝦是我國對蝦養(yǎng)殖的重要品種，由于其相對較耐低溫，而且抗病害能力較強，近年其養(yǎng)殖面積和規(guī)模迅速增加，尤其是在北方。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，日本囊對蝦健康養(yǎng)殖的環(huán)境也越來越嚴(yán)峻，病害爆發(fā)越來越頻繁。金屬硫蛋白（Metallothionein，簡稱:MT）是一類廣泛存在于生物體中的低分子量金屬結(jié)合蛋白，具有解毒重金屬、清除體內(nèi)自由基、參與免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能。MT的重金屬解毒功能能夠減少重金屬類殺菌殺蟲藥物和環(huán)境污染重金屬對對蝦的毒性。眾

2、多學(xué)者認(rèn)為MT具有作為環(huán)境重金屬污染監(jiān)測生物指標(biāo)的潛質(zhì)。MT的以上功能使其在對蝦健康養(yǎng)殖中具有很大的潛在應(yīng)用前景。
　　本文以日本囊對蝦為研究對象，采用常規(guī)PCR、RACE等方法，首次獲得了日本囊對蝦MT cNDA基因，采用生物信息學(xué)的方法對其cDNA及基因序列、所編碼蛋白的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了預(yù)測和分析。研究了重金屬Cd2+對日本囊對蝦幼蝦的毒性，通過Real-Time PCR探索了MT在日本囊對蝦各組織中的表達(dá)水平，

3、以及在重金屬Cd2+污染處理時，肝胰腺中MTmRNA的表達(dá)量變化。獲得了以下主要結(jié)果:
　　1.日本囊對蝦MT cDNA（GeneBank登錄號:KP226136）序列全長549bp，包含177bp的開放閱讀框(ORF)，68bp的5'非編碼區(qū)(UTR)及304bp3'非編碼區(qū)(UTR)，編碼58個氨基酸。序列對比結(jié)果顯示，日本囊對蝦MTcDNA序列與斑節(jié)對蝦的金屬硫蛋白cDNA序列相似度最高，為76％。通過軟件分析得出日本囊對蝦

4、MT的理論分子質(zhì)量為6180.3Da，等電點8.28，不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為51.66，脂肪族指數(shù)為3.45，不含信號肽。親水性總平均值（GRAVY）值為-0.719，是親水性蛋白。
　　2.采用Real-Time PCR技術(shù)分析了MT在日本囊對蝦各組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示MT基因在不同組織中廣泛表達(dá)，在日本囊對蝦的肝胰腺、鰓、胃、腸、肌肉、心臟、眼柄中均有檢測到表達(dá)，但表達(dá)量存在差異。表達(dá)量最高的組織是鰓，其次是胃和肝胰腺。其他組織如

5、肌肉、心臟、眼柄、腸的表達(dá)量都非常低。
　　3.日本囊對蝦重金屬Cd2+的96h毒理實驗表明，Cd2+對日本囊對蝦幼蝦（平均體重為3.43g）的安全濃度為7.76μmol/L(0.88ppm)。在Cd2+的96h污染實驗條件下，隨著環(huán)境重金屬Cd2+濃度的升高，MT的表達(dá)量也隨之升高。日本囊對蝦重金屬Cd2+的30d污染實驗表明，日本囊對蝦肝胰腺MT的表達(dá)量存在上限，當(dāng)實驗蝦表達(dá)的MT不足以解除Cd2+毒性時，產(chǎn)生Cd2+中毒。在