‘富士’蘋果紅色芽變果實金屬硫蛋白基因的克隆與表達分析.pdf

1、MolecularCloningandExpressionAnalysisofTwoMetallothioneinGenesin‘Fuji，AppleanditsRedMutant(MalusdomesticaBorkhCVFuji)ThesissubmittedtoQngdaoAgriculturalUniversityInFulfi1ImentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronom

2、y，一一ZhongZhaodi(DepartmentofHorticulture)Supervisor：YuanYongbingQingdaoChinaJune，2013青島農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文摘要‘富士’蘋果紅色芽變果實金屬硫蛋白基因的克隆與表達分析摘要金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類能夠結(jié)合重金屬的富含半胱氨酸(Cys)低分子量蛋白質(zhì)，廣泛分布于生物界，目前已從多種生物中克隆到了金屬硫蛋白基因，很多研究表明，

3、金屬硫蛋白的表達在不同的組織和不同的生長發(fā)育時期存在著明顯的基因差異，而且其在植物生長中的作用目前不是十分明確。本研究從本實驗室構建的‘富士’蘋果紅色芽變果實的SSH文庫中克隆出兩個金屬硫蛋白基因，利用實時熒光定量PCR技術，對這兩個金屬硫蛋白基因在不同部位和不同時期的表達進行了初步研究，構建了原核表達載體并誘導融合蛋白表達，為以后蘋果金屬硫蛋白的獲得和研究奠定了基礎，此外還構建了植物雙元表達載體和植物亞細胞定位表達載體，以方便進一步研

4、究蘋果金屬硫蛋白基因在植物生長發(fā)育過程中的作用和金屬硫蛋白基因在植物細胞中的表達部位。1蘋果金屬硫蛋白基因(MdMT2、MdMT3)的克隆本文根據(jù)從構建好的SSH文庫中獲得的ESTq歹】為模板，設計引物，利用RACEPCR技術，獲得兩個金屬硫蛋白基因的cDNA全長，分別將其命名為MdMT2和MdMT3。^锨^仍的全長為639bp，基因內(nèi)部包括一個長度為240bp可編碼79個氨基酸的開放閱讀框(ORF)，^織^仃；的全長為495bp，基因

5、內(nèi)部包括一個長度為201bpff綁566個氨基酸的開放閱讀框(ORF)。2MdMT2、MdMT3基因編碼的蛋白的生物學分析利用相關生物分析軟件和程序分析基因編碼的蛋白的結(jié)構特點和性質(zhì)，MdMT2蛋白預測的蛋白分子量為77938Da，等電點為475，分子式為C297H483N910114S20，且MdMT2具有一個Metallothio2superfamily結(jié)構功能域，跨膜預測分析MdMT2蛋白是膜間蛋白。MdMT3預測的蛋白分子量為6

6、9297Da，等電點為478，分子式為C275‰2N820103S12，跨膜預測分析^紀^仍蛋白為膜內(nèi)蛋白。3Real—timePCR分析MdMT2、MdMT3基因的表達采用實時熒光定量PCR：JL術，分別分析了MdMT2、MdMT3基因在蘋果果實發(fā)育不同時期的果皮中的表達差異和在葉片、花、莖，果皮、果肉五個不同器官部位中的表達差異，結(jié)果表明MdMT2在芽變富士和普通富士中的表達趨勢一致，都是在成熟果皮中的相對表達量最高，但在芽變富士中