‘國光’蘋果紅色芽變果實著色分子機理初步研究.pdf

1、蘋果（Malus domestica Borkh)是世界上最主要的鮮食果品之一，其果實色澤是重要的外觀品質(zhì)，直接決定其商品價值?！畤?是20世紀(jì)80年代中國北方廣泛種植的蘋果品種之一，具有晚熟、酸甜適口及抗逆性強等特點，近年來再次受到消費者的青睞，但著色差一直是限制其發(fā)展的重要因素。2005年課題組在山東省五蓮縣發(fā)現(xiàn)了一株‘國光'的紅色突變，其突出的特點是比國光著色早，著色好，成熟時果面片紅。果皮的紅色主要由花青苷類物質(zhì)的含量和成分決

2、定的，花青苷是由一系列的酶促反應(yīng)生成的次生代謝物。前人以‘國光'為對照，從生理層面上對紅色芽變花青苷積累及合成途徑關(guān)鍵酶的活性進行了研究。本文在此基礎(chǔ)上，比較了兩試材中花青苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因的表達水平以及三個調(diào)節(jié)基因的編碼區(qū)，找出了引發(fā)紅色突變的關(guān)鍵基因；并通過對關(guān)鍵基因MdMYB1基因組和上、下游調(diào)控序列的擴增和比對，以及MdMYB1啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)的比較，闡明了MdMYB1表達量差異的原因。主要研究結(jié)果如下：

3、　　 1.果實發(fā)育后期正常光照條件下的果實MdCHS、MdF3H、和 MdUFGT表達量逐漸上升，采收前達到最大值；MdCHI、MdDFR1及MdLDOX的表達量亦逐漸上升，但在采收前略有下降；套袋處理（盛花后30天套袋，采收前30天除袋）的果實除袋前花青苷合成結(jié)構(gòu)基因表達量均很低，除袋后迅速上升；與正常光照條件下的果實相比，套袋處理明顯提高了MdDFR1，MdLDOX及 MdUFGT的表達水平，但兩不同光照處理MdCHS，MdCHI

4、和 MdF3H的表達差異不大。兩種試材相對比，不同光照處理下紅色芽變6個結(jié)構(gòu)基因表達水平均不同程度地高于‘國光'，且位于合成途徑下游的結(jié)構(gòu)基因表達量差異更加明顯。類黃酮合成另兩條分支途徑中，黃酮醇合成酶基因MdFLS的表達水平明顯低于‘國光'，而單寧生物合成途徑中無色花色素還原酶基因MdLAR1和MdANR的表達量在兩種試材中差異不明顯，僅個別階段芽變表達量略低。
　　 2.根據(jù)MdMYB1，MdbHLH3及 MdbHLH33的

5、cDNA序列設(shè)計特異引物，分別從‘國光'及其紅色芽變中克隆出以上三個花青苷合成調(diào)節(jié)基因的編碼區(qū)并進行測序比對。結(jié)果表明兩種試材中MdMYB1和 MdbHLH3兩種調(diào)節(jié)基因的編碼序列完全一致，編碼結(jié)構(gòu)相同的蛋白質(zhì)；MdbHLH33蛋白的結(jié)構(gòu)略有差異：氨基酸序列中第304位的氨基酸不同，‘國光'為甲硫氨酸（Met），而芽變中為蘇氨酸（Thr）。
　　 3．正常光照條件下，MdMYB1的表達量隨著果實成熟逐漸升高，后期達到最大值并略微

6、呈現(xiàn)下降趨勢；套袋處理果實除袋前MdMYB1表達量很低，除袋后迅速上升。與正常光照條件下的果實相比，套袋處理明顯提高了MdMYB1的表達水平。兩種試材相對比，不同光照處理下芽變MdMYB1的表達量均明顯高于‘國光'。MdbHLH3的表達與花青苷積累相關(guān)性不明顯，MdbHLH33的表達與MdMYB1顯著相關(guān)；兩試材MdbHLH3和MdbHLH33的表達量無明顯差異。
　　 4.對‘國光'及其芽變MdMYB1基因組及上、下游序列進行

7、克隆比對，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示對應(yīng)序列的長度無差異，說明芽變MdMYB1內(nèi)含子及上、下游調(diào)節(jié)序列中無基因片段如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等插入或缺失；對基因片段進行測序比對，也未發(fā)現(xiàn)兩種試材中有明顯差異，說明芽變MdMYB1未發(fā)生DNA水平上的變化。對兩種試材MdMYB1啟動子區(qū)甲基化水平進行比較，發(fā)現(xiàn)紅色芽變-965～-416區(qū)域甲基化水平明顯低于‘國光'。
　　 綜上所述，紅色芽變中花青苷合成結(jié)構(gòu)基因表達水平協(xié)同上調(diào)；MdMYB1表達量